劉霞，薛旭亮，繆松，柳國霞，鄧凱波*

（1.福建農(nóng)林大學 食品科學學院，福建 福州 350002；2.中國-愛爾蘭國際合作食品物質(zhì)學與結(jié)構(gòu)設(shè)計研究中心，福建 福州 350002；3.福建省特種淀粉品質(zhì)科學與加工技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350002；4.愛爾蘭農(nóng)業(yè)部Teagasc食品研究中心，愛爾蘭 科克 P61C996；5.中國科學院 微生物生理與代謝工程重點實驗室，北京 100101）

抗性淀粉（resistant starch，RS）是一種益生元，廣泛存在于淀粉及含淀粉的食物中，具有可被結(jié)腸細菌發(fā)酵并生成短鏈脂肪酸的特性，可在腸道內(nèi)作為碳源促進雙歧桿菌的生長[1-2]。雙歧桿菌是人和動物腸道中具有重要生理功能的一類益生菌，對宿主發(fā)揮生物屏障、內(nèi)毒素血癥、抗腫瘤、抗衰老、促進機體免疫機能等生理功能[3-4]。腸道菌群紊亂會引發(fā)腸道疾病，嚴重影響人體健康。作為腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，雙歧桿菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用[5]。但人體內(nèi)的雙歧桿菌數(shù)量會隨著個體年齡增長或腸道內(nèi)環(huán)境的影響下降，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[6]。

有研究表明，高直鏈玉米抗性淀粉可提高雙歧桿菌在低pH值、膽鹽環(huán)境及小鼠腸道中的存活能力，提出細菌對淀粉的黏附作用可能是提高菌體存活能力的機制之一[7]。因此，可以開發(fā)一種淀粉基益生元來促進腸道中雙歧桿菌增殖，調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡。但目前對抗性淀粉與雙歧桿菌的黏附機制尚不清楚，推測具有黏附性的雙歧桿菌與淀粉的結(jié)合機制涉及一種特異性的細胞表面蛋白[8]。蓮子中直鏈淀粉含量高，有利于形成Ⅲ型抗性淀粉（RS3），Ⅲ型蓮子抗性淀粉（lotus seed resistant starch，LRS3）穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)、粗糙的溝壑狀表面和空腔凹陷可以與雙歧桿菌更好的黏附[9]。

目前關(guān)于LRS3的研究多為制備方法優(yōu)化及其益生功能，而抗性淀粉與雙歧桿菌黏附機制的研究相對較少。本研究以蓮子抗性淀粉和雙歧桿菌為研究對象，通過分析抗性淀粉與雙歧桿菌黏附作用的影響因素來探究兩者之間的黏附機制，以期為制備二者的高黏附體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮蓮：綠田（福建）食品有限公司；短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）ATCC 15700、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）ATCC 15697、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）ATCC 2952、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）ATCC 15703：廣東省微生物菌種保藏中心；胃蛋白酶（3 000 U/g～3 500 U/g）、α-淀粉酶（100 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）、膽鹽（膽酸含量65%）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型雙人單面垂直凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；Allegra X-30R型臺式高速離心機：美國Beckman Coulter公司；SpectraMax i3x型酶標儀、Utech PH700型pH計：賽默飛世爾科技有限公司；NanoZS90型馬爾文粒度分析儀：英國Malvern公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波法制備蓮子抗性淀粉

參照Zhang等[10]的方法，將一定質(zhì)量的蓮子淀粉配制成一定濃度的淀粉乳。將淀粉乳置于微波爐中，640 W加熱2 min～4 min，使淀粉糊化。65℃烘干，粉碎，過80目篩，得到粗提LRS3。加入α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶，用蒸餾水洗滌沉淀，得到酶解純化的LRS3。

1.3.2 菌種活化

挑取冷凍保藏的4種供試雙歧桿菌粉末在TPY瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)48 h厭氧培養(yǎng)后，挑取單菌落于5 mL TPY液體培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)36 h，再以2.0%接種量轉(zhuǎn)接到5 mL TPY液體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代2次～3次，使菌株完全活化。

1.3.3 LRS3與雙歧桿菌黏附率的測定

將對數(shù)期雙歧桿菌菌體用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH7.0） 洗滌 2 次后，重懸于相同緩沖溶液中至細胞終濃度約為107CFU/mL。取其中2 mL細胞重懸液與LRS3重懸液（10 g/L，0.1 mol/L PBS，pH7.0）在直徑1 cm試管中同體積徹底混勻。室溫下靜置1 h至淀粉沉淀后，在液面下0.5 cm處吸取兩份150 μL樣液，酶標儀測定540 nm下吸光值a，以PBS為空白對照。黏附于抗性淀粉上細菌比例（黏附率）按公式（1）計算。

式中：b為不添加細菌的淀粉重懸液OD540值；c為不添加淀粉的細菌重懸液OD540值[11]。

1.3.4 黏附作用影響因素研究

以1.3.3中所述黏附率的測定方法為基礎(chǔ)，進行多條件變量試驗設(shè)計[11-12]，系統(tǒng)探討生長介質(zhì)、疏水相互作用、靜電相互作用、細菌表面蛋白及溫度等條件對LRS3與4株供試雙歧桿菌黏附作用的影響。黏附試驗的基本操作同1.3.3黏附率測定方法，其中各變量條件試驗中使用的處理方法見表1，每個試驗3次重復(fù)。

表1 黏附影響因素變量試驗的處理方法Table 1 Treatments used in the experiments of variable adhesion influenceable factors

1.3.5 菌體表面疏水性的測定

疏水性是通過細菌對碳氫化合物的黏附性測試來測定的[13-14]，具體來說，將菌懸液在室溫下離心（6 000 r/min，10 min），收集的菌體經(jīng) 0.1 mol/L PBS（pH7.0）洗滌2次后，重懸于無菌0.1 mol/L KNO3溶液中。在540 nm處調(diào)節(jié)吸光度為0.50±0.02，記作A0。取3 mL菌懸液與1 mL二甲苯混勻后在室溫靜置10 min（此時形成兩相體系）。將兩相體系渦旋振蕩2 min后再靜置20 min，重新形成兩相體系（水相和有機相）。小心吸取水相，在540 nm下測定吸光度（A）。按公式（2）計算細菌表面疏水性，重復(fù)3次試驗取平均值。

1.3.6 模擬上消化道條件對黏附的影響

為了確定雙歧桿菌通過胃和小腸對LRS3黏附的影響，在模擬上消化道生理條件的體外條件下進行了黏附試驗[15]。pH值、胃蛋白酶、胰蛋白酶和膽汁對黏附影響的處理方法如表2所示。所有試驗均重復(fù)3次。

表2 模擬上消化道條件下黏附的處理方法Table 2 Treatments for adhesion determination under simulated upper digestive tract

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計和制圖，SPSS 20.0進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長介質(zhì)對黏附作用的影響

處于對數(shù)期的4株雙歧桿菌均可與LRS3發(fā)生黏附反應(yīng)，其黏附率分別為82.83%（B.longum）、85.27%（B.adolescentis）、71.13%（B.breve） 和 75.13%（B.bifidum）。其中，前兩種為成年人體內(nèi)的優(yōu)勢菌株，后兩種為嬰兒體內(nèi)的優(yōu)勢菌株。黏附率的差異說明菌株與LRS3的黏附之間存在菌株差異性，也可能存在不同的黏附機制。通過篩選不同雙歧桿菌的表面黏附素已發(fā)現(xiàn)，不同菌株表面可能存在不同的與黏附有關(guān)的蛋白質(zhì)[16]，而這有可能是影響菌株與淀粉黏附的因素之一。不同生長介質(zhì)對LRS3黏附雙歧桿菌的影響如圖1所示。

圖1 不同生長介質(zhì)對LRS3與雙歧桿菌黏附作用的影響Fig.1 Influence of growing medium on the adhesion between LRS3 and Bifidobacteria

從圖1中可以看出，加入的生長介質(zhì)均對LRS3與雙歧桿菌的黏附作用產(chǎn)生了抑制作用，且其抑制作用的強度順序為直鏈淀粉>麥芽糖>葡萄糖。其中，葡萄糖對LRS3與B.longum黏附的抑制作用最大，黏附率降低了7.87%，而對LRS3與B.breve黏附的抑制作用最小，只降低了4.83%。麥芽糖對LRS3與B.adolescentis黏附的抑制作用最明顯，黏附率降低了25.2%，而LRS3與B.breve、B.longum和B.bifidum 黏附率則分別降低了15.3%、19.8%和15.6%。故總體上麥芽糖對黏附體系的抑制程度比葡萄糖高。與對照組相比，直鏈淀粉對4株菌的抑制作用最明顯，其中直鏈淀粉顯著抑制了LRS3與雙歧桿菌的黏附（P<0.05），其對LRS3與B.longum黏附的抑制作用最大，黏附率降低達38.97%。葡萄糖、麥芽糖、直鏈淀粉均可作為雙歧桿菌生長的碳源，但將這些碳源添加到LRS3與雙歧桿菌的黏附體系中時，由于不同雙歧桿菌的碳源運輸系統(tǒng)不同[16-17]，導(dǎo)致LRS3與雙歧桿菌的黏附率在含有不同碳源的黏附體系中表現(xiàn)出不同程度的差異。盡管葡萄糖在小程度上抑制了黏附，但隨著淀粉聚合物長度的增加，抑制程度隨之增加。這表明黏附體系中的關(guān)鍵因子可能對較大分子具有更高的親和力；也可能是較大淀粉聚合物的更大空間位阻，更有效的阻斷了淀粉顆粒與細菌表面的黏附相互作用。這與Ghalia等[18]研究結(jié)果一致。

2.2 細胞表面疏水性對黏附作用的影響

細菌表面疏水性取決于細菌表面非極性基團的數(shù)量，多與黏附現(xiàn)象有關(guān)[8]。菌體表面的理化性質(zhì)很大程度上依賴于表面疏水程度，較高的表面疏水性意味著在水相體系中與非極性物質(zhì)具有較高的結(jié)合能力[19]。圖2展示了供試菌株的細胞表面疏水性對LRS3與菌株黏附作用的影響。

圖2 疏水性對LRS3與菌株黏附作用的影響Fig.2 Influence of hydrophobic interaction on the adhesion between LRS3 and Bifidobacteria

菌株表面的疏水性與LRS3之間的黏附率存在弱相關(guān)性。由圖2可知，在成人腸道中處于高豐度水平的B.longum和B.adolescentis[20]，后者與LRS3黏附率更高，而疏水性卻低于前者。由此可見雙歧桿菌細胞表面疏水性在黏附LRS3的過程中會產(chǎn)生一定的作用，但仍存在其他影響因素。具有疏水性的細菌更傾向于黏附具有疏水性表面的碳源[21]。Niderman-Meyer等[22]使用兩種不同的有機溶劑作為疏水相，發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌（Vibrio cholerae）對不同碳氫化合物的黏附程度不同。細菌表面疏水性對LRS3黏附作用的影響也可能是由于黏附條件的不同而不同，細胞在中性pH值或稀釋的緩沖液中可能不會黏附在碳氫化合物上，但在低pH值或高離子強度介質(zhì)中則會黏附。

2.3 靜電相互作用對黏附作用的影響

靜電相互作用介導(dǎo)黏附需要帶有相反電荷的離子，表3為不同離子強度下LRS3與供試菌株黏附體系的電位值變化情況。

表3 不同離子強度下LRS3與供試菌株黏附體系的電位值Table 3 Electric potential values of adhesion systems of LRS3 and Bifidobacteria under different ion strengths mV

經(jīng)測定，LRS3與雙歧桿菌均帶負電荷，因此其黏附體系也均為負電位。在添加了NaCl后，引入的陽離子與體系原有粒子電荷相反，雖中和了一部分體系負電，但黏附體系仍帶負電荷，且電位值均隨NaCl濃度的增高而顯著減?。≒<0.05）。

長距離靜電力可能影響細菌黏附到LRS3表面的初始階段，這種相互作用會以雙向方式（即吸引力或排斥力）影響?zhàn)じ竭^程[23]。圖3為添加不同濃度NaCl對二者黏附作用的影響。

圖3 離子強度對LRS3與菌株黏附作用的影響Fig.3 Influence of ion strength on the adhesion between LRS3 and Bifidobacteria

由圖3可知，當NaCl濃度在0～0.5 mmol/L時，供試菌的黏附率大體隨離子強度增大而降低，而當NaCl濃度為0.8 mmol/L時，黏附率卻均呈顯著升高趨勢。陽離子的加入可以把雙歧桿菌細胞壁上的負電荷和LRS3的負電荷通過靜電作用結(jié)合起來，起到中間橋梁的作用。研究結(jié)果表明，當陽離子的加入量達到一定的濃度時，會使體系的黏附率相對提高，這表明靜電相互作用對黏附體系具有一定的影響。

2.4 蛋白酶K處理對黏附作用的影響

蛋白酶K處理的雙歧桿菌與LRS3的黏附作用見圖4。

圖4 蛋白酶K處理的雙歧桿菌與LRS3的黏附作用Fig.4 Adhesion of LRS3 to proteinase K treated Bifidobactiria

由圖4可知，蛋白酶K對LRS3與4株雙歧桿菌的黏附能力均產(chǎn)生了顯著的抑制作用（P<0.05），其中對B.adolescentis的抑制作用最明顯，黏附率降幅達35.99%；對LRS3與B.longum和B.bifidum的抑制作用相對較小，降幅約23%。有研究發(fā)現(xiàn)，LRS3與雙歧桿菌的黏附可能是由于細菌細胞表面蛋白或糖蛋白沒有黏附任何與淀粉顆粒有關(guān)的蛋白質(zhì)或肽鏈[24]。蛋白酶K對菌株的處理可對其表面蛋白產(chǎn)生降解作用，本研究中黏附水平的顯著降低表明，在雙歧桿菌與LRS3的黏附中，細菌表面蛋白可能參與了該過程，并起到較為關(guān)鍵的作用。

2.5 菌株熱處理對黏附作用的影響

不同溫度處理后的雙歧桿菌與LRS3的黏附作用見圖5。

圖5 不同溫度處理后的雙歧桿菌與LRS3的黏附作用Fig.5 Adhesion of Bifidobacteria to LRS3 after different temperature treatment

由圖5可知，菌株熱處理對黏附率存在較大影響。總體上來說，40℃～60℃組雙歧桿菌與LRS3的黏附率隨溫度升高呈顯著下降趨勢（P<0.05），其中，各菌株40℃組的黏附率均最接近室溫對照組，B.adolescentis組黏附率最高（80.87%），B.bifidum組最低（69.16%）；60℃時的黏附率受抑制程度最大，LRS3與B.longum的黏附率降幅達40.53%，推測其可能原因是高溫使菌體表面蛋白（包括可能的黏附蛋白）變性[25]，低溫則會使蛋白質(zhì)的活性降低，導(dǎo)致黏附率下降。而30℃組黏附率的普遍低值，其原因可能為雙歧桿菌的最適宜生長溫度為37℃～41℃，過低（30℃）或過高（50℃及以上）溫度均可能影響菌株各成分生理功能的發(fā)揮，但30℃處理相對高溫對黏附率的抑制程度較小，說明LRS3與雙歧桿菌結(jié)合的關(guān)鍵黏附因子對高溫更敏感，這也從一個側(cè)面說明了LRS3與雙歧桿菌的黏附可能與細胞的表面蛋白有關(guān)。

2.6 模擬上消化道條件對黏附作用的影響

2.6.1 pH值對黏附作用的影響

宿主菌對淀粉的物理性黏附可能是其利用碳源的前提條件，與碳源的利用性有關(guān)[18]。LRS3和雙歧桿菌作為較好的人體益生元和益生菌物質(zhì)，其黏附體系在胃和小腸逆環(huán)境中的適應(yīng)性也關(guān)系到二者益生功能的作用程度。pH值對LRS3與雙歧桿菌黏附作用的影響見圖6。

圖6 pH值對LRS3與雙歧桿菌黏附作用的影響Fig.6 Effects of pH value on adhesion between LRS3 and Bifidobacteria

由圖6可知，與對照組相比，pH值為3時LRS3與4株雙歧桿菌黏附率的抑制程度均最為顯著（P＜0.05），其中 B.bifidum組黏附率由 75.17%降至16.82%，降幅達68.34%。由于雙歧桿菌的最適宜生存環(huán)境為pH6.5～7.0，高酸性環(huán)境可導(dǎo)致菌株酶活被抑制、蛋白質(zhì)變性及代謝過程改變等，因此高酸性環(huán)境可能使菌株表面蛋白等黏附關(guān)鍵物質(zhì)的功能受到影響，而致黏附率大幅下降。然而，pH5、pH7和pH9環(huán)境則對LRS3與供試菌的黏附率影響較小，尤其是在雙歧桿菌最適宜pH值時黏附率相對最高，即4株供試菌與LRS3均在pH7環(huán)境下表現(xiàn)出最佳黏附效果。因此可以推斷，體系的黏附率與環(huán)境pH值有關(guān)，且在菌株可表現(xiàn)出最佳活力的環(huán)境中效果最好。

2.6.2 消化道蛋白酶對黏附作用的影響

蛋白酶處理對LRS3與雙歧桿菌黏附作用的影響見圖7。

圖7 蛋白酶處理對LRS3與雙歧桿菌黏附作用的影響Fig.7 Effects of pretease treatment on adhesion between LRS3 and Bifidobacteria

由圖7可知，LRS3與雙歧桿菌的黏附對消化道胃蛋白酶和胰蛋白酶均敏感，酶處理會使蛋白質(zhì)的活性降低，從而降低二者的黏附率。用胃蛋白酶處理時發(fā)現(xiàn)，LRS3與4株雙歧桿菌的黏附率都受到明顯的抑制（P＜0.05），與LRS3黏附率較好的B.longum在胃蛋白酶的處理下黏附率為18.93%，其余3株的黏附率也都僅為15%左右，推測二者黏附體系在通過胃的過程中損失較大。胰蛋白酶對二者黏附體系也有明顯的抑制作用（P＜0.05），與胃蛋白酶相同，胰蛋白酶對LRS3與B.adolescentis的黏附抑制率也為最高，黏附率從85.8%降至28.25%；LRS3與B.breve的黏附率也降低了43.3%。這與蛋白酶K、熱處理及pH值影響?zhàn)じ阶饔玫慕Y(jié)果互相印證，說明LRS3與雙歧桿菌之間的黏附關(guān)鍵因子可能包括黏附相關(guān)蛋白。胰腺分泌物含有淀粉分解酶，影響淀粉顆粒表面，在胰腺消化后觀察到黏附水平顯著降低，這表明黏附可能涉及淀粉顆粒表面一些糖苷的特異性[22]。

2.6.3 消化道膽鹽對黏附作用的影響

膽鹽濃度對LRS3與雙歧桿菌黏附作用的影響見圖8。

圖8 膽鹽濃度對LRS3與雙歧桿菌黏附作用的影響Fig.8 Effects of bile salt concentration on adhesion between LRS3 and Bifidobacteria

由圖8可知，不同濃度的消化道膽鹽也均對LRS3與雙歧桿菌的黏附產(chǎn)生了抑制作用。其中，膽汁濃度0.2 g/L的膽鹽濃度對體系的黏附抑制程度最高（P＜0.05），LRS3與B.longum的黏附降低至56.63%。而隨著膽鹽濃度的不斷降低，其對LRS3與雙歧桿菌的黏附抑制作用越來越弱，當膽鹽濃度為0.002 g/L時，B.breve和B.longum兩組的黏附率已與其對照組無顯著差異（P＞0.05）。對此，研究發(fā)現(xiàn)膽鹽在到達一定濃度后會抑制二者的黏附，但是隨著濃度的降低，抑制作用幾乎不存在。腸道中的總膽汁濃度為1 g/L～10 g/L，但游離膽汁濃度因在腸道的不同區(qū)域和人體攝入脂質(zhì)的量而異。當膽汁分泌量增加時，膽汁會抑制雙歧桿菌對不溶性膳食纖維的黏附。相反，膽汁被重吸收后大腸中游離膽汁濃度較低，使雙歧桿菌容易黏附在不溶性膳食纖維上。而且在膽汁和低pH值存在的情況下，抗性淀粉的加入可促進雙歧桿菌在大鼠腸道中的存活[26]。

3 結(jié)論

細菌對顆粒淀粉的黏附作用是其降解的首要步驟，也是有效降解的先決條件。LRS3與雙歧桿菌間的良好黏附有利于改善二者的營養(yǎng)互作關(guān)系。對不同環(huán)境條件下LRS3與雙歧桿菌黏附作用的研究結(jié)果表明，LRS3與雙歧桿菌的黏附作用不受靜電相互作用的影響，而疏水相互作用對二者黏附體系的影響存在菌株差異性。同時，在低pH值、蛋白酶處理及高膽鹽濃度等條件下，體系的黏附作用會受到顯著抑制，這與在V.cholerae等菌中的現(xiàn)有結(jié)果一致，推測LRS3與雙歧桿菌的黏附作用機理可能也與一類特異性的細胞表面蛋白相關(guān)，這為進一步揭示黏附機制指明了方向，也為高黏附體系的制備及其在合生元開發(fā)方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。