張新燦，郭浩然，張靜，李小定

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

桑葚是?？?、桑屬、植物桑的成熟果實(shí)，新鮮的桑葚不僅含有大量的游離酸、氨基酸、葡萄糖、礦物質(zhì)、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，還含有花青素、多糖、維生素C、1-脫氧野尻霉素、白藜蘆醇等生物活性物質(zhì)，有明目、保肝、清除自由基、降血壓等重要作用[2-3]。由于桑葚成熟期集中、采收不易、果皮薄、果實(shí)較軟等原因，使得桑葚保鮮和儲(chǔ)藏性較差，在室溫下很快變色、變質(zhì)。因此，桑葚常被加工成桑葚干、桑葚酒、桑葚飲料、果漿等產(chǎn)品，以增加產(chǎn)品附加值和延長(zhǎng)貨架期。桑葚及其加工產(chǎn)品是我們生活中常見的富含花青素的食品，桑葚中的花青素主要為矢車菊素[4]，花青素具有抗癌、抗炎、降血脂、保護(hù)視力、美容等功效，在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]。但不同加工方式對(duì)花青素含量及穩(wěn)定性有不同的影響，溫度、光照、氧化等因素都會(huì)影響花青素的穩(wěn)定性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，25℃是花青素最穩(wěn)定的溫度，當(dāng)溫度升高到60℃時(shí)，花青素就會(huì)以查爾酮式結(jié)構(gòu)存在，穩(wěn)定性變差，顏色變?yōu)闊o色[5]。謝程程等[6]的研究表明長(zhǎng)時(shí)間光照也會(huì)誘導(dǎo)花青素碳骨架C2位斷開，形成C4羥基的降解產(chǎn)物，之后被氧化為查耳酮，查耳酮進(jìn)一步被氧化為苯甲酸及2，4，6-三羥基苯甲醛等水解產(chǎn)物，導(dǎo)致花色苷降解。近年來，我國已有關(guān)于藍(lán)莓[7]、蔓越莓[8]、紫薯[9]等植物花青素的研究，而關(guān)于桑葚花青素的研究主要集中于提取和純化方面[10-12]，缺少有關(guān)桑葚花青素的穩(wěn)定性研究，而研究桑葚花青素在不同產(chǎn)品中的穩(wěn)定性對(duì)其加工質(zhì)量的表征有重要意義。

本文研究光照、溫度、氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3對(duì)桑葚干和桑葚酒中花青素的影響，比較桑葚干和桑葚酒提取物清除DPPH、ABTS+自由基能力，探究表征桑葚花青素穩(wěn)定性的指標(biāo)，比較桑葚花青素在不同樣品中的穩(wěn)定性，以期為桑葚的加工利用和桑葚花青素的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚干、桑葚酒（桑葚品種為無核大十）：圣源酒業(yè)有限公司。桑葚酒制備工藝要點(diǎn)：桑葚→榨汁→發(fā)酵→過濾→陳釀→過濾→滅菌→桑葚酒。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：美國 Sigma-Aldrich 公司；維生素 C（VC）、沒食子酸（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；乙醇、鹽酸、乙醛、H2O2溶液、Na2SO3（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2）：國華電器有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)（島津UV-1500型）：杭州庫侖科技有限公司；pH計(jì)（FE20）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高速冷凍離心機(jī)（H1850R）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52A）：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

桑葚干在室溫（25℃）避光條件下充分研磨、凍干后得桑葚干粉末。取桑葚干粉末和桑葚酒，50℃黑暗條件下按料液比1∶20（質(zhì)量比）用酸性乙醇[0.1%鹽酸∶95%乙醇=40∶60（體積比）]浸提 2 次，每次 90 min，合并2次浸提液，4℃下10 000 r/min離心15 min，浸提液真空抽濾除渣，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40℃下濃縮，濃縮液冷凍干燥后得桑葚干和桑葚酒花青素提取物[13]。分別稱取兩種提取物用4倍質(zhì)量的酸性乙醇定容，得桑葚干和桑葚酒花青素提取液，用于各指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 pH示差法測(cè)花青素含量

準(zhǔn)確量取桑葚干和桑葚酒花青素提取液0.5 mL至10 mL容量瓶中，分別用pH值為1.0和4.5的緩沖液定容至10 mL，置于30℃水浴40 min，冷卻至室溫。以蒸餾水為空白對(duì)照，分別在519 nm和700 nm處測(cè)吸光值，以矢車菊素-3-葡萄糖苷計(jì)，按照Fuleki公式計(jì)算花青素含量[14]。

式中：ΔA為桑葚干和桑葚酒花青素提取液的吸光值差；A519nm為樣品在519 nm處的吸光值；A700nm為樣品在700 nm處的吸光值；c為桑葚干和桑葚酒中花青素含量，mg/100 g；DF 為稀釋倍數(shù)，20；M 為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2 g/mol；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；L為光程，1 cm。

1.3.3 桑葚干和桑葚酒中不同類型花青素占比的測(cè)定

將桑葚干和桑葚酒花青素提取液pH值調(diào)至3.6，分別取2 mL提取液加入20%的乙醛20 μL，搖勻靜置45 min，另取2mL提取液加入5%的Na2SO3溶液160 μL，另取100 μL桑葚干和桑葚酒提取液加入1 900 μL酒石酸緩沖液，分別在520 nm處測(cè)定吸光值，按以下公式計(jì)算聚合型、輔色型和游離型花青素占比[15]。

式中：A1為加入乙醛后桑葚干和桑葚酒花青素提取液在520 nm處的吸光值；A2為加入Na2SO3溶液后桑葚干和桑葚酒花青素提取液在520 nm處的吸光值；A3為加入酒石酸緩沖液后桑葚干和桑葚酒花青素提取液在520 nm處的吸光值。

1.3.4 多酚含量的測(cè)定

參照劉馥源等[16]的方法略作改進(jìn)，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu法[17]進(jìn)行多酚含量的測(cè)定。精確稱取10 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，待完全溶解后定容至50 mL，得到濃度為0.2mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，并用蒸餾水加至1mL后加入1mL福林酚試劑，搖勻后避光靜置6 min，再加入5 mL 5%碳酸鈉溶液，充分混合后定容至25 mL避光放置1 h，在760 nm處測(cè)定各溶液的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取桑葚干和桑葚酒花青素提取液按上述方法測(cè)定760nm處的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（方程y=0.1249x+0.0372，R2=0.9984）計(jì)算其多酚含量。

1.3.5 花青素穩(wěn)定性比較

1.3.5.1 光照及光照時(shí)間對(duì)花青素的影響

取10 mL桑葚干和桑葚酒花青素提取液于離心管中，密封后室溫（25℃）置于光照度為600 lx的白熾燈下，每天相同時(shí)間測(cè)定花青素含量，連續(xù)測(cè)定5 d。

1.3.5.2 溫度及保溫時(shí)間對(duì)花青素的影響

取10 mL桑葚干和桑葚酒花青素提取液于離心管中，密封避光置于60℃水浴鍋中，每1 h測(cè)定花青素含量，連續(xù)測(cè)定5 h。

1.3.5.3 氧化劑H2O2對(duì)花青素的影響

向裝有10 mL桑葚干和桑葚酒花青素提取液的離心管中分別加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的H2O2溶液，密封后室溫（25℃）避光靜置2 h，測(cè)定花青素含量。

1.3.5.4 還原劑Na2SO3對(duì)花青素的影響

向裝有10 mL桑葚干和桑葚酒花青素提取液的離心管中分別加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的Na2SO3溶液，密封后室溫（25℃）避光靜置2 h，測(cè)定花青素含量。

1.3.5.5 DPPH自由基清除率的測(cè)定

分別稱取桑葚干和桑葚酒花青素提取液，用無水乙醇配制濃度為 1、2、3、4、5、10 mg/mL 的樣品溶液，分別量取2 mL樣品溶液加入到裝有2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液的離心管中，空白組加入2 mL無水乙醇和2 mL對(duì)應(yīng)濃度的樣品溶液，VC為陽性對(duì)照，室溫（25℃）避光靜置30 min，517 nm處測(cè)定吸光值。計(jì)算自由基清除率和半數(shù)抑制率濃度（IC50）[18]。

式中：A1為加入樣品后的吸光值；A2為空白組吸光值；A3為陽性對(duì)照組吸光值。

1.3.5.6 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

將7 mmol/L ABTS溶液與140 mmol/L過硫酸鉀按體積比250∶11混合，室溫（25℃）避光靜置24h，得ABTS儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液用0.1 mol/L磷酸緩沖液稀釋，使其在734nm處的吸光值為0.70±0.02，得ABTS工作液[8]。稱取桑葚干和桑葚酒花青素提取液，用無水乙醇配制質(zhì)量濃度為 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的樣品溶液，分別量取2mL樣品溶液加入到裝有8mLABTS工作液的離心管中，空白組加入8mL無水乙醇和2mL對(duì)應(yīng)濃度的樣品溶液，VC為陽性對(duì)照，室溫（25℃）避光靜置8 min，734 nm處測(cè)定吸光值。計(jì)算自由基清除率和IC50[18]。

式中：A1為加入樣品后的吸光值；A2為空白組吸光值；A3為陽性對(duì)照組吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Origin 2021軟件作圖，IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's法進(jìn)行顯著性分析，雙變量簡(jiǎn)單相關(guān)進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算以及差異顯著性檢驗(yàn)，p<0.05為顯著性差異判別標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑葚干和桑葚酒中不同類型花青素含量比較

桑葚干和桑葚酒中不同類型花青素占比如圖1所示。

圖1 桑葚干和桑葚酒中不同類型花青素占比Fig.1 Proportion of different types of anthocyanin in dried mulberry and mulberry wine

由圖1可知，兩種產(chǎn)品中聚合型花青素含量最高，輔色型花青素次之，游離型花青素含量最低。桑葚干中聚合型花青素占比47.91%，輔色型花青素占比26.94%，游離型花青素占比25.15%。桑葚酒中三者分別占比62.93%，25.68%，11.39%。桑葚酒中聚合型花青素占比顯著高于桑葚干（p<0.05），而游離型花青素占比顯著低于桑葚干（p<0.05），輔色型花青素占比無顯著差異（p>0.05）。說明桑葚經(jīng)發(fā)酵后聚合型花青素占比增加，游離型花青素占比減少。研究表明，在葡萄酒貯藏過程中游離型花青素與輔色型花青素之間存在化學(xué)平衡，游離型花青素也可以反應(yīng)生成聚合型花青素[15]。所以推測(cè)在桑葚酒中可能也存在類似現(xiàn)象，此結(jié)果可能會(huì)造成兩種產(chǎn)品中花青素穩(wěn)定性的差異。

2.2 多酚含量比較

桑葚干和桑葚酒花青素提取物中多酚含量如圖2所示。

圖2 桑葚干和桑葚酒中多酚含量Fig.2 Polyphenol content in dried mulberry and mulberry wine

由圖2可知，桑葚酒花青素提取物中多酚含量略高于桑葚干，但兩者無顯著差異（p>0.05）。此結(jié)果表明，桑葚干和桑葚酒中的花青素表現(xiàn)出對(duì)光照、溫度、氧化劑和還原劑的穩(wěn)定性、對(duì)自由基清除能力的差異與多酚含量關(guān)系不大。

2.3 花青素穩(wěn)定性比較

2.3.1 光照及光照時(shí)間對(duì)花青素的影響

光照及光照時(shí)間對(duì)花青素的影響如圖3所示。

由圖3可知，光照條件下，桑葚干和桑葚酒提取物中花青素含量逐漸減少。第1天開始桑葚干和桑葚酒中花青素含量存在顯著差異（p<0.05），5 d后，桑葚酒提取物中花青素含量顯著高于桑葚干。因?yàn)楣庹諘?huì)導(dǎo)致花青素碳骨架的C2位斷開，花青素被氧化為苯甲酸及苯甲醛等產(chǎn)物[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)光照條件下，桑葚干提取物中花青素含量低于桑葚酒提取物，這是因?yàn)樯］鼐浦械幕ㄇ嗨嘏c發(fā)酵過程中的糖代謝產(chǎn)物或有機(jī)酸的脫羧產(chǎn)物通過加成反應(yīng)生成更穩(wěn)定的吡喃型花青素，吡喃型花青素在C4位與C5位之間形成吡喃環(huán)而處于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，保護(hù)花青素不易受外界條件影響[20]。

圖3 光照及光照時(shí)間對(duì)花青素的影響Fig.3 Effect of light and lighting time on anthocyanin

2.3.2 溫度及保溫時(shí)間對(duì)花青素的影響

除光照外，溫度也是影響花青素穩(wěn)定性的重要因素。圖4為60℃下桑葚干和桑葚酒提取物中花青素含量的變化。

圖4 溫度及保溫時(shí)間對(duì)花青素的影響Fig.4 Effect of temperature and soaking time on anthocyanin

由圖4可知，隨保溫時(shí)間延長(zhǎng)，兩種提取物中花青素含量均逐漸減少，2 h開始桑葚干和桑葚酒中花青素含量存在顯著差異（p<0.05），2 h后發(fā)現(xiàn)，桑葚酒提取物中花青素含量減少程度變緩，5 h時(shí)桑葚酒提取物中花青素含量顯著高于桑葚干提取物（p<0.05）。原因可能是聚合型花青素分解釋放出游離型花青素，使得游離型花青素含量增加。

2.3.3 氧化劑H2O2對(duì)花青素的影響

向桑葚干和桑葚酒花青素提取液中加入H2O2后，花青素含量變化如圖5所示。

圖5 H2O2添加量對(duì)花青素的影響Fig.5 Effect of H2O2addition on anthocyanin

由圖5可知，H2O2添加量越多，花青素含量越少。原因是花青素的高度不飽和結(jié)構(gòu)使其對(duì)氧化劑頗為敏感，H2O2對(duì)桑葚干和桑葚酒提取物中的花青素產(chǎn)生強(qiáng)烈的破壞作用，H2O2能與花青素C2位發(fā)生親核反應(yīng)，使吡喃環(huán)裂開而產(chǎn)生無色的酯和香豆素衍生物，再進(jìn)一步降解或聚合，最終產(chǎn)生褐色沉淀物[20]。0～2.0 mL H2O2添加量下，桑葚酒提取物中花青素含量均顯著高于桑葚干提取物（p<0.05）。原因是桑葚酒中可能存在其他抗氧化物質(zhì)，如黃酮醇等，這些抗氧化物質(zhì)與花青素共同起作用，從而保護(hù)花青素并減少其消耗[21-22]，說明桑葚酒花青素提取液對(duì)H2O2的耐受性強(qiáng)于桑葚干。

2.3.4 還原劑Na2SO3對(duì)花青素的影響

向桑葚干和桑葚酒花青素提取液中加入Na2SO3溶液后，花青素含量變化如圖6所示。

圖6 Na2SO3添加量對(duì)花青素的影響Fig.6 Effect of Na2SO3addition on anthocyanin

由圖6可知，Na2SO3溶液添加量為0.2 mL時(shí)，桑葚干和桑葚酒提取物中花青素含量顯著降低（p<0.05），當(dāng)Na2SO3溶液添加量為1.0 mL時(shí)，桑葚干提取物中花青素含量?jī)H為25 mg/100 g，而對(duì)應(yīng)的桑葚酒提取物中花青素含量為40 mg/100 g，顯著高于桑葚干提取物（p<0.05），并且在0～1.0mL Na2SO3溶液添加量下，桑葚酒提取物中花青素含量均顯著高于桑葚干（p<0.05）。說明桑葚酒花青素提取物對(duì)SO2耐受性要強(qiáng)于桑葚干，原因是花青素在桑葚酒中轉(zhuǎn)變?yōu)檫拎突ㄇ嗨?，普通的花青素碳骨架的C4位與SO2發(fā)生加成反應(yīng)而褪色，而吡喃型花青素碳骨架的C4位形成新的環(huán)，阻止SO2的親核反應(yīng)[23]，從而避免了花青素與SO2發(fā)生加成反應(yīng)。

2.3.5 DPPH自由基清除能力比較

桑葚干和桑葚酒花青素提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖7所示。

圖7 DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging capacity

由圖7可知，隨花青素提取物濃度的增加，DPPH自由基清除率增加。當(dāng)桑葚酒花青素提取物濃度為10 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到94%，而此時(shí)桑葚干僅為72%。

表1為DPPH自由基清除率的回歸方程及IC50。

表1 DPPH自由基清除率的回歸方程及IC50Table 1 Regression equation of DPPH free radical scavenging rate and IC50

由表1可知，桑葚干和桑葚酒提取物的IC50分別為3.93 mg/mL和3.05 mg/mL，表明桑葚酒提取物清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于桑葚干。

2.3.6 ABTS+自由基能力比較

在氧化劑的作用下，ABTS會(huì)被氧化成綠色的ABTS，自由基存在時(shí)ABTS+的產(chǎn)生會(huì)被抑制，從而達(dá)到清除自由基的目的。桑葚干和桑葚酒花青素提取物對(duì)ABTS自由基清除能力如圖8所示。

由圖8可知，隨提取物濃度增大，ABTS+自由基清除率增加。當(dāng)桑葚酒提取物濃度為2.5 mg/mL時(shí)，ABTS+自由基清除率達(dá)到95%，而此時(shí)桑葚干提取物僅為75%。

圖8 ABTS+自由基清除能力Fig.8 ABTS+free radical scavenging capacity

表2為ABTS+自由基清除率的回歸方程及IC50。

表2 ABTS+自由基清除率的回歸方程及IC50Table 2 Regression equation of ABTS+free radical scavenging rate and IC50

由表2可知，桑葚干和桑葚酒花青素提取物的IC50分別為3.55 mg/mL和3.05 mg/mL，表明桑葚酒提取物清除ABTS+自由基能力強(qiáng)于桑葚干。有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)花青素具有很強(qiáng)的自由基清除能力，其抗氧化性能比VE高50倍，比VC高20倍[24]。花青素的抗氧化活性來源于多酚分子中的酚羥基，分子中所含的酚羥基越多，其抗氧化性越強(qiáng)，更利于脫氫形成供氫體，打斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。桑葚酒花青素提取物的自由基清除率高于桑葚干提取物，原因可能是桑葚酒中花青素含量較高或桑葚酒中還存在其他的自由基清除劑[24-25]，與花青素共同起作用。

2.4 相關(guān)性分析

穩(wěn)定性指標(biāo)與不同類型花青素所占比重的相關(guān)性分析如表3所示。

表3 穩(wěn)定性指標(biāo)與不同類型花青素所占比重的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between stability index and proportion of polymerized anthocyanins

由表3可知，光照、溫度和H2O2對(duì)花青素的穩(wěn)定性、花青素清除DPPH、ABTS+自由基能力與聚合型花青素占比呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（p<0.05），說明表征花青素穩(wěn)定性的指標(biāo)可能是聚合型花青素所占比重，桑葚酒中花青素的穩(wěn)定性高可能是因?yàn)榫酆闲突ㄇ嗨厮急戎馗螅送?，花青素中的聚合型花青素可能是其具有抗氧化作用的原因。吡喃型花色苷和其他分子形成的新的花色苷，可以歸為聚合型花青素，吡喃型花青素也可稱為聚合型花青素，二者并沒有非常嚴(yán)格的界定[26-27]。桑葚酒中聚合型花青素含量較高的原因是花青素與發(fā)酵過程中的糖代謝產(chǎn)物或有機(jī)酸的脫羧產(chǎn)物發(fā)生加成反應(yīng)生成更穩(wěn)定的吡喃型花青素[28-29]，這可能是桑葚酒中花青素穩(wěn)定性較桑葚干高的原因。

3 結(jié)論

本文研究光照、溫度、氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3對(duì)桑葚干和桑葚酒中花青素的影響，比較兩種產(chǎn)品花青素提取物清除DPPH、ABTS+自由基能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑葚干和桑葚酒花青素提取物中多酚含量無顯著差異。桑葚酒提取物中聚合型花青素所占比顯著增加，游離型花青素所占比重顯著降低，輔色型花青素含量沒有明顯變化；光照、溫度、氧化劑和還原劑對(duì)桑葚干提取物中花青素的影響大于桑葚酒；桑葚酒花青素提取物清除DPPH、ABTS+自由基能力強(qiáng)于桑葚干提取物；相關(guān)性分析結(jié)果表明，光照、溫度和H2O2對(duì)花青素的穩(wěn)定性、花青素清除DPPH、ABTS+自由基能力與聚合型花青素占比呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（p<0.05），說明表征花青素的穩(wěn)定性指標(biāo)可能是聚合型花青素所占比重。綜上所述，桑葚酒中花青素的穩(wěn)定性強(qiáng)于桑葚干，更能耐受光照、溫度、氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3所造成的影響，且其抗氧化能力強(qiáng)于桑葚干，更能滿足消費(fèi)者對(duì)桑葚花青素的需求。