鄭 潔，開震天，夏超然，羅 鵬，劉 暉，王建東，王 鳳，胡俊艷△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院乳腺外科，上海 201203；2.上海鼎晶生物醫(yī)藥科技股份有限公司，上海 201321

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。根據(jù)最新全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌已上升為全球發(fā)病率第一的惡性腫瘤，其中約有75%的乳腺癌患者為雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌[1]，內(nèi)分泌治療是該類乳腺癌的重要治療策略，包括選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、芳香化酶抑制劑、孕激素、卵巢功能抑制劑等。他莫昔芬可使雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者的5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降至33.2%，5年病死率降至25.6%[2]，但仍有40%左右的內(nèi)分泌治療患者出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)他莫昔芬耐藥，導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后。因此，臨床亟待找到可以早期預(yù)估雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者耐藥風(fēng)險(xiǎn)的靶點(diǎn)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA具有多種重要的功能，可影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后修飾、表觀遺傳修飾等多種生理、病理過(guò)程，其轉(zhuǎn)錄或功能的異?？纱龠M(jìn)或抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥性產(chǎn)生[3-4]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的表達(dá)差異與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及治療耐藥密切相關(guān)[5-7]。

近年來(lái)，基于高通量平臺(tái)的微陣列已成為篩選癌癥發(fā)生過(guò)程中重要的遺傳或表觀遺傳學(xué)改變的有效工具，并且利用該技術(shù)去尋找癌癥診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物具有廣闊前景。本研究利用基因表達(dá)綜合(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)提取雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌芯片測(cè)序數(shù)據(jù)，并篩選雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者群體中出現(xiàn)他莫昔芬耐藥的lncRNA，從而分析乳腺癌他莫昔芬耐藥的分子機(jī)制及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載及處理 使用R包GEOquery從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載他莫昔芬耐藥及敏感細(xì)胞系的lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集，編號(hào)為GSE159981，用于挖掘他莫昔芬耐藥相關(guān)的差異lncRNA。TANRIC(https://ibl.mdanderson.org/tanric/design/basic/main.html)數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)涵蓋了20種癌癥lncRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中數(shù)據(jù)來(lái)源包括癌癥基因組圖譜(TCGA)、癌癥細(xì)胞系百科全書(CCLE)及大量的獨(dú)立數(shù)據(jù)集，可用于探索lncRNA在各種癌癥中的功能及臨床相關(guān)性。本研究從其中下載TCGA乳腺癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，共837例，并從UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取TCGA乳腺癌患者及所對(duì)應(yīng)的生存數(shù)據(jù)，用于建立預(yù)后模型。

1.2生物信息分析

1.2.1差異lncRNA分析 使用R包GEOquery讀取GSE159981數(shù)據(jù)集中GPL 20115平臺(tái)對(duì)應(yīng)的注釋文件。將其中標(biāo)記為lncRNA的探針提取出來(lái)，并統(tǒng)一使用lncRNA ID進(jìn)行注釋。隨后，使用R包limma對(duì)他莫昔芬敏感組MCF-7與他莫昔芬耐藥組LCC-2中的lncRNA進(jìn)行t檢驗(yàn)。然后，按照錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)矯正P值<0.05且|log2FC|>1.5(FC為差異倍數(shù))的標(biāo)準(zhǔn)篩選其中的差異lncRNA。最后，使用R包ggplot2繪制差異lncRNA的火山圖。

1.2.2預(yù)后模型建立與分析 使用R包biomaRt注釋TCGA基因表達(dá)譜中的基因名，并將篩選出來(lái)的差異lncRNA與TCGA的基因表達(dá)譜中包含的lncRNA取交集。隨后，對(duì)上述交集部分的lncRNA進(jìn)行單因素Cox回歸分析，計(jì)算每個(gè)lncRNA與乳腺癌總生存率的風(fēng)險(xiǎn)值及P值，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出與預(yù)后顯著相關(guān)的他莫昔芬耐藥lncRNA，表達(dá)量完全一致的lncRNA中僅保留一個(gè)。為保證模型的穩(wěn)定性，在訓(xùn)練集中采用多因素Cox回歸分析建立預(yù)后模型。將所建模型計(jì)算得到的風(fēng)險(xiǎn)值按中位數(shù)將患者分為高危組和低危組，使用R包中的survival和survminer繪制兩組患者的Kaplan-Meier曲線并采用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組患者的生存差異。

1.2.3預(yù)后模型的驗(yàn)證 利用所建立的模型計(jì)算出TCGA乳腺癌驗(yàn)證集中的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)，按照相同閾值將患者劃分為高危組及低危組，繪制兩組患者的生存曲線并用Log-rank檢驗(yàn)兩組患者的生存差異。

2 結(jié) 果

2.1差異lncRNA的篩選 以FDR<0.05及|log2FC|>1.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在他莫昔芬敏感組與他莫昔芬耐藥組中找到差異lncRNA 共416個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的lncRNA 200個(gè)，下調(diào)表達(dá)的lncRNA 216個(gè)。FDR排序前十位的差異lncRNA和對(duì)應(yīng)P值見表1。

表1 他莫昔芬耐藥相關(guān)的差異lncRNA(FDR排序前十位)

2.2預(yù)后模型建立 將找出的差異lncRNA與TCGA基因表達(dá)譜中重疊的部分進(jìn)行比對(duì)，最終獲得116個(gè)lncRNA。對(duì)116個(gè)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行單因素Cox回歸分析，以計(jì)算各lncRNA與乳腺癌患者總生存率的HR與P值，得到8個(gè)顯著相關(guān)的lncRNA(P<0.05)，見表2。隨后，將TCGA隨機(jī)分為訓(xùn)練集(n=470)與驗(yàn)證集(n=157)，并在訓(xùn)練集中利用多因素Cox回歸對(duì)上述8個(gè)lncRNA進(jìn)行多因素Cox回歸分析，最終確立6個(gè)lncRNA(ENSG00000230440、ENSG00000231128、ENSG00000232986、ENSG00000249346、ENSG00000253898、ENSG00000258412)的預(yù)后模型。按照所建模型計(jì)算得到的HR的中位數(shù)進(jìn)行區(qū)分，將患者分為高危組和低危組，并進(jìn)行生存分析。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高危組與低危組在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中的生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=7×10-7、0.008)。

表2 8個(gè)lncRNA的單因素分析結(jié)果

2.36個(gè)lncRNA預(yù)測(cè)預(yù)后的受試者工作特征(ROC)曲線 使用R包timeROC分別計(jì)算3年及5年生存率的曲線下面積(AUC)，并繪制出相應(yīng)的ROC曲線以評(píng)價(jià)模型的特異度和靈敏度。在整體數(shù)據(jù)集中，所構(gòu)建的6個(gè)lncRNA預(yù)后模型的3年和5年生存率AUC分別為0.75和0.68(圖1)，均能較好的預(yù)測(cè)出乳腺癌患者的生存情況。

圖1 6個(gè)lncRNA預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

他莫昔芬是一種結(jié)構(gòu)與雌激素相似的人工合成的非甾體類抗雌激素藥，它通過(guò)與雌激素競(jìng)爭(zhēng)腫瘤細(xì)胞雌激素受體，減少雌激素與受體有效結(jié)合，阻止雌激素發(fā)揮有效作用，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[8]。雖然他莫昔芬的使用明顯改善了雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者的預(yù)后，但不可忽視的耐藥問(wèn)題嚴(yán)重影響了他莫昔芬的整體療效，因此找到特異性的且有治療意義的內(nèi)分泌治療耐藥靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

在對(duì)他莫昔芬耐藥的探索中，lncRNA的作用越來(lái)越被人重視，也取得了一些成果，比如有WU等[9]發(fā)現(xiàn)，lncRNA UCA1可通過(guò)激活mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)他莫昔芬產(chǎn)生耐藥。多項(xiàng)研究表明，lncRNA HOTAIR可與雌激素受體相互作用，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)他莫昔芬耐藥[10-12]。李均勇等[13]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5在MCF-7/他莫昔芬耐藥細(xì)胞中呈低表達(dá)，lncRNA GAS5過(guò)表達(dá)后MCF-7/他莫昔芬耐藥細(xì)胞增殖活性降低、對(duì)他莫昔芬敏感性增強(qiáng)，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-223-5p，進(jìn)而抑制下游PI3K/Akt通路表達(dá)有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA BCAR4可通過(guò)HER2信號(hào)通路參與乳腺癌的細(xì)胞侵襲和他莫昔芬耐藥[12]。

本文主要是基于GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)他莫昔芬在乳腺癌治療中的耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，從中篩選出與他莫昔芬耐藥相關(guān)的lncRNA，并構(gòu)建出能夠用于評(píng)估患者生存狀態(tài)的6個(gè)lncRNA預(yù)后模型。此預(yù)后模型提示高風(fēng)險(xiǎn)及低風(fēng)險(xiǎn)患者的生存曲線存在著明顯的分離。與高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者相比，低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的生存時(shí)間延長(zhǎng)、預(yù)后較好，表明lncRNA在雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌內(nèi)分泌治療療效及預(yù)后中可能起著一定作用。

目前，對(duì)于乳腺癌內(nèi)分泌治療患者來(lái)說(shuō)，仍然缺少能夠有效判斷內(nèi)分泌治療療效及預(yù)后的工具。本研究中較少的lncRNA(6個(gè))便可預(yù)測(cè)內(nèi)分泌治療的效果及預(yù)后，為乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療方案選擇提供參考。同時(shí)，本研究報(bào)道的6個(gè)lncRNA均為現(xiàn)有文獻(xiàn)尚鮮見報(bào)道與他莫昔芬耐藥相關(guān)的標(biāo)志物，可能成為研究乳腺癌他莫昔芬耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)耐藥的新靶點(diǎn)。

但本研究存在一定的局限性，由于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)具有一定的誤差及背景噪聲[14]，本研究雖然在分析前已對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及批次校正，且通過(guò)獨(dú)立訓(xùn)練集和驗(yàn)證集初步驗(yàn)證了模型的穩(wěn)定性，但結(jié)果仍需進(jìn)一步結(jié)合大量臨床標(biāo)本及預(yù)后數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證其在臨床應(yīng)用的價(jià)值。

綜上所述，本研究針對(duì)雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌構(gòu)建了他莫昔芬耐藥相關(guān)的6個(gè)lncRNA預(yù)后模型，并初步顯示了該模型預(yù)測(cè)他莫昔芬耐藥風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)后情況及進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)他莫昔芬耐藥、治療癌癥的潛力。