(廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北 廊坊 065001)

D-阿洛酮糖(D-psicose/D-allulose)是一種稀有糖,自Itoh等[1]首次報道以來已有近30年歷史。D-阿洛酮糖具有蔗糖70%的甜度,可與食物中的氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應,改善食物色澤,且其提供熱量較少,僅相當于同等質(zhì)量蔗糖的0.3%[2],不會給人體帶來額外的消化負擔,對人體不構(gòu)成健康威脅。2011年8月,美國食品與藥物管理局(FDA)確定D-阿洛酮糖為普遍公認安全食品(Generally regarded as safe,GRAS),可作為食品或食品添加劑的組成成分[3]。

D-阿洛酮糖已陸續(xù)在日本、韓國、美國和澳大利亞等國家批準上市,其市場規(guī)模在不斷增加。目前,我國與歐盟正在受理D-阿洛酮糖作為新食品原料的申請,預計可在2024年前獲批。隨著獲批國家的增多,D-阿洛酮糖的市場規(guī)模也將保持快速增長,在未來有望替代食品工業(yè)中常規(guī)糖分所占據(jù)的廣闊市場,在提高人們營養(yǎng)健康水平方面發(fā)揮積極作用。

1 D-阿洛酮糖特性

1.1 D-阿洛酮糖簡介

D-阿洛酮糖是一種稀有糖,分子式為C6H12O6,分子量為180.16,它是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體,D-果糖的分子結(jié)構(gòu)式為

D-阿洛酮糖純品為白色粉末狀晶體,極易溶于水，可溶于甲醇和乙醇,不溶于丙酮,自然界中D-阿洛酮糖分布極少,可見于少部分植物和少數(shù)細菌中。此外,D-阿洛酮糖也出現(xiàn)在各種人工制作食品中,如水果干、果醬和糖制品等,這些食品一般都有高糖的特點,D-阿洛酮糖在各類食品中的質(zhì)量分數(shù)與生產(chǎn)過程中的溫度和加熱時間密切相關(guān)[4]。D-阿洛酮糖的分子結(jié)構(gòu)式為

1.2 阿洛酮糖功能特性

1) 高甜度與低能量

雖然D-阿洛酮糖可同等程度地滿足消費者對甜味的味覺需求,但是其僅提供相當于同等質(zhì)量蔗糖0.3%的熱量,可作為食品中蔗糖最理想的替代品。對大鼠連續(xù)喂食D-果糖、蔗糖與D-阿洛酮糖20 d后,喂食阿洛酮糖的大鼠體重增加量最小,能量計算結(jié)果顯示D-阿洛酮糖提供的有效能量幾乎為0,意味著D-阿洛酮糖產(chǎn)生的能量最低[2]。

2) 抑制血糖升高

多項研究證明D-阿洛酮糖具有降血糖的功效。分別以蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉喂食大鼠,同時喂食少量D-阿洛酮糖或果糖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖能夠顯著抑制由蔗糖和麥芽糖引起的血糖升高,對于可溶性淀粉引起的血糖升高作用并不明顯。進一步的研究發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖能抑制腸道蔗糖酶和麥芽糖酶活性,降低腸道對這兩種糖類的吸收,達到抑制血糖升高的效果[5]。單獨服用D-阿洛酮糖(7.5 g)也不會引起血液中血糖與胰島素水平的變化[6]。D-阿洛酮糖還可抑制餐后血糖水平的升高,可作為臨界型糖尿病患者的輔助治療劑,在連續(xù)攝入D-阿洛酮糖12周后沒有觀察到任何副作用或不良反應[7]。

3) 降低脂肪積累

肥胖與高熱量和高糖分食物的攝入息息相關(guān),D-阿洛酮糖甜味劑不僅幾乎不提供任何熱量,而且能降低小腸對蔗糖、麥芽糖等糖類的吸收速率以及生物體內(nèi)脂肪合成酶的活性,提高脂肪氧化酶表達水平,通過抑制脂肪合成速率和提高脂肪分解速率而有效控制體重,治療肥胖[7-8]。

4) 安 全 性

作為一種主要應用于食品領(lǐng)域的甜味劑,D-阿洛酮糖的安全性至關(guān)重要。為了驗證D-阿洛酮糖的安全性,有研究者對大鼠進行了長達18個月的D-阿洛酮糖口服毒性研究,長期給予大鼠D-阿洛酮糖飲食后,除大鼠肝臟和腎臟的相對重量有所增加外,未觀察到其他異常情況,隨后肝臟和腎臟組織的病理學觀察結(jié)果顯示這兩種器官未出現(xiàn)因攝入D-阿洛酮糖而產(chǎn)生的異常[9]。

2 D-阿洛酮糖的制備

自然界中天然存在的D-阿洛酮糖極少,部分植物與細菌中含有少量的D-阿洛酮糖。目前,D-阿洛酮糖的大規(guī)模獲取主要來自于人工合成,主要有化學合成與生物合成兩種方式,化學合成法存在產(chǎn)量低、副產(chǎn)物多和產(chǎn)物分離困難等問題,生物合成法則更為環(huán)保,副產(chǎn)物少,更利于后續(xù)產(chǎn)物的分離純化。根據(jù)生物合成D-阿洛酮糖所需要原材料的不同,其生物合成途徑有:1)D-果糖通過異構(gòu)化反應生成D-阿洛酮糖;2) 以葡萄糖為原料,先由葡萄糖異構(gòu)酶或木糖異構(gòu)酶獲得D-果糖,再由DTE或DPE催化D-果糖獲得D-阿洛酮糖;3) 由阿洛醇通過氧化還原反應得到D-阿洛酮糖。

2.1 D-果糖異構(gòu)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖

2.1.1 異構(gòu)化酶的篩選及來源

通過生物酶催化將D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖是目前大部分生物法生產(chǎn)D-阿洛酮糖的基礎(chǔ),D-果糖異構(gòu)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的途徑如圖1所示。這些生物酶主要有D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase,DTE)和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶由Izumori等[10]首次發(fā)現(xiàn),因其最適底物為塔格糖,故命名為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶。2006年韓國Kim等[11]成功克隆表達了根瘤農(nóng)桿菌的DTE,該DTE可催化所有己酮糖在C-3位置的差向異構(gòu)反應,且對D-阿洛酮糖的底物特異性最高,其次是D-果糖和D-塔格糖。因此,該酶是一種新的差向異構(gòu)酶,被更名為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。

圖1 果糖異構(gòu)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖

雖然DTE與DPE可催化相似的反應,即單糖C-3位置的差向異構(gòu)反應,但是由于它們的來源不同,因此彼此之間的氨基酸序列同源性差異很大,氨基酸相似度一般在23.9%～94.2%[12]。目前已有3種DTE酶家族成員的晶體結(jié)構(gòu)被成功解析,分別是AgrobacteriumtumefaciensDPE[13],PseudomonascichoriiDTE[14]和ClostridiumcellulolyticumDPE[15],這3種DTE酶家族成員的晶體結(jié)構(gòu)表明DTE具有同源二聚體的酶分子結(jié)構(gòu),而其他兩種DPE是同源四聚體的酶分子結(jié)構(gòu)。天然狀態(tài)下，DTE與DPE更適宜中性或弱堿性環(huán)境,它們的最適催化溫度分布范圍廣泛,一般為40～75 ℃;此外,與DTE相比,DPE多具有金屬離子依賴性,最適金屬離子為Mn2+和Co2+,這些金屬離子在提高酶的活性與熱穩(wěn)定性方面具有重要作用[16]。隨著已發(fā)現(xiàn)的DTE與DPE越來越多,它們組成了一個新家族—DTE酶家族[17]。迄今為止，研究者們已先后在瘤胃球菌(Ruminococcussp.)[18]、梭狀芽孢桿菌(Clostridiumcellulolyticum)[19]和類球紅細菌(RhodobactersphaeroidesSK011)[20]等菌株中發(fā)現(xiàn)新的DTE酶家族成員。國內(nèi)關(guān)于D-阿洛酮糖的研究起步較晚,江南大學率先發(fā)現(xiàn)一種可產(chǎn)DTE的類球紅細菌,轉(zhuǎn)化率最高達6.54%[21],這也是國內(nèi)首次報道發(fā)現(xiàn)具有生物轉(zhuǎn)化D-果糖生成D-阿洛酮糖功能的菌株。隨后,天津工業(yè)生物技術(shù)研究所Zhu等[18]在瘤胃球菌中也發(fā)現(xiàn)了D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶,目前已發(fā)現(xiàn)的DTE酶家族成員如表1所示,表1中轉(zhuǎn)化率均為最適條件下數(shù)據(jù)。

表1 不同微生物來源的DTE和DPE及其性質(zhì)

雖然天然菌種產(chǎn)生的DTE可用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn),但是已報道的天然DTE多為胞內(nèi)酶,不僅需要分離純化后才能使用,而且產(chǎn)量較低,催化效率以及酶穩(wěn)定性都有待提高。相較于化學法,該方法產(chǎn)生的DTE用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn)雖然可以提高D-阿洛酮糖的生產(chǎn)效率,但是也會帶來非常高的生產(chǎn)成本,并且在D-阿洛酮糖生產(chǎn)初期添加的是游離酶,這使得DTE難以重復利用且在與產(chǎn)物的分離過程中增加額外的成本。

2.1.2 固定化酶催化技術(shù)生產(chǎn)D-阿洛酮糖

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,研究者對天然DTE進行了分子改造,如將DTE改為胞外分泌、更換DTE的生產(chǎn)宿主等[34-36]。對根瘤農(nóng)桿菌的DPE基因進行隨機和定點突變,獲得高熱穩(wěn)定性的DPE,延長DPE在高溫下(≥50 ℃)的半衰期,有利于果糖異構(gòu)化反應正向進行,提高D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率[35]。與游離酶相比,固定化酶可重復使用并利于產(chǎn)品分離,可以有效降低生產(chǎn)成本,延長酶的使用周期。Itoh等[1]首次對DTE進行固定化操作,以殼聚糖為固定化載體,在pH 7.5,45 ℃條件下反應10 d后阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率為18%。Lim等[37]以離子交換樹脂為載體固定DPE,在pH 8.5,50 ℃條件下,最終D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率為29%。此外,為提高酶分子固定化的牢固程度,在酶分子多肽鏈的一端引入帶電荷的氨基酸側(cè)鏈,增加電荷數(shù)量并用離子交換樹脂進行吸附固定,該方法對酶進行固定化且不涉及酶的分離純化,直接使用粗酶液即可,降低了生產(chǎn)成本[38]。

2.1.3 全細胞催化生產(chǎn)D-阿洛酮糖

全細胞催化技術(shù)的興起再一次改變D-阿洛酮糖的生產(chǎn)方式,利用工程菌表達DTE并分泌到胞外,可以將D-果糖原料與菌液混合以進行D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。相比酶催化方法,利用全細胞生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)稀有糖頗受歡迎,因為它可以避免酶的提取與分離純化,既可以省去繁瑣的操作步驟,又可以降低生產(chǎn)成本。Park等[39]將根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的DPE基因異源表達于大腸桿菌中,重組大腸桿菌細胞24 h的DPE表達量為8.6%,表明該酶具有較高表達量,在pH 8.5,60 ℃條件下重組細胞可在40 min內(nèi)轉(zhuǎn)化700 g/L的D-果糖產(chǎn)生230 g/L的D-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率為33%(以質(zhì)量計,下同)。此外,來源于F.plautii的DAEase基因在大腸桿菌中異源表達,以果糖為底物在pH 7.5,65 ℃反應條件下,添加2.4 g的重組大腸桿菌,60 min后轉(zhuǎn)化率也可達到33%,即使延長催化時間或增加底物質(zhì)量濃度反應率也沒有明顯提高,意味全細胞催化可以在較高的果糖質(zhì)量濃度下進行,提高菌體的利用效率[40]。

在以果糖為底物轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的過程中,果糖的質(zhì)量濃度不能無限制地提高,過高的果糖質(zhì)量濃度(<800 g/L)會導致菌體細胞裂解,從而降低轉(zhuǎn)化率[41]。隨著反應的不斷進行,果糖質(zhì)量濃度也會隨之降低,D-阿洛酮糖質(zhì)量濃度的增加會抑制反應的正向進行,此時若能對底物果糖進行補充,則能提高果糖質(zhì)量濃度,此舉不僅能促進反應正向進行,也能起到提高菌體利用率的作用。王洋[41]采用大腸桿菌工程菌進行全細胞催化,以質(zhì)量濃度為300 g/L的果糖為初始底物,每隔6 h添加一定量的果糖以及終質(zhì)量濃度為20 g/L的新鮮全細胞,經(jīng)6次補料后D-阿洛酮糖產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達到110 g/L和36%,而不進行補料的實驗組D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率僅為18.45%,實驗結(jié)果表明全細胞補料轉(zhuǎn)化可進一步提升D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率。

全細胞催化生產(chǎn)D-阿洛酮糖常用大腸桿菌作為DTE表達宿主,目前大部分相關(guān)文獻報道也都是以大腸桿菌為主,雖然其操作系統(tǒng)成熟,培養(yǎng)簡單且細胞生長迅速,并且以大腸桿菌作為DTE酶家族成員的異源表達系統(tǒng)往往都可以取得比較高的轉(zhuǎn)化效率,但是大腸桿菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素,使其在食品工業(yè)中的應用受到限制。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和各類酵母菌也是常用表達系統(tǒng),這些菌株均不含內(nèi)毒素,操作系統(tǒng)較為成熟,菌體生長迅速,常被作為食品級酶表達的優(yōu)良宿主[42]。

Wang等[43]構(gòu)建了枯草芽孢桿菌WB600中異源表達A.tumefaciensDPE的工程菌株,優(yōu)化發(fā)酵條件后,重組枯草芽孢桿菌細胞以果糖為底物生產(chǎn)D-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率為29.01%。大多數(shù)DPE的最佳反應溫度>50 ℃(表1),對細胞造成了嚴重的損傷,導致細胞裂解。因此,Wang等[43]又以海藻酸鈣固定化重組枯草芽孢桿菌細胞,在pH 8,50 ℃條件下,將固定化細胞轉(zhuǎn)化率降至20.74%,并且此時固定化細胞的pH和溫度穩(wěn)定性相較于游離細胞都有所提升,有利于提高重組菌重復利用性,節(jié)省生產(chǎn)成本。

李燦[38]構(gòu)建了來自于菌Ruminococcussp.的DTE,以短芽孢桿菌作為表達宿主,該工程菌株具有較高的DTE表達量,所產(chǎn)的胞外DTE經(jīng)固定化后,以100 g/L的果糖為底物,反應6 h,可得到30%的D-阿洛酮糖。同樣條件下，利用該菌株的固定化細胞反應6 h后可得到29.3%的D-阿洛酮糖。各類酵母菌也是常用的食品級酶表達宿主,Yang等[44]報道了一株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)工程菌株,該菌株能夠異源表達Agrobacteriumtumefaciens的DTE,利用該工程菌株作為生物催化劑,以750 g/L的D-果糖為底物,55 ℃反應12 h得到190 g/L的D-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率達25.3%。雖然由枯草芽孢桿菌或酵母菌作為表達宿主產(chǎn)生D-阿洛酮糖,其生產(chǎn)轉(zhuǎn)化率一般低于大腸桿菌(大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率可達33%),但是枯草芽孢桿菌和酵母菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素,這對可作為食品原料的D-阿洛酮糖來說尤為重要,因此未來以全細胞催化方式生產(chǎn)D-阿洛酮糖枯草芽孢桿菌和各類酵母菌將是宿主菌的最佳選擇,關(guān)于這兩大類菌的研究也將會成為熱點。

2.1.4 提高異構(gòu)化反應效率

DTE催化D-果糖到D-阿洛酮糖的反應為可逆反應,在反應達到平衡以后,不會有額外的D-阿洛酮糖生成,因此D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率普遍較低,約30%,這也是D-阿洛酮糖產(chǎn)量低的主要原因之一。針對該問題,目前有兩種解決方案:1) 提高異構(gòu)化反應溫度,對于吸熱反應,升高溫度可使反應物活化分子數(shù)增多,增強分子間有效碰撞,提高反應速率，加快產(chǎn)物生成,以促進反應的正向進行;2) 反應過程中及時移走生成物,這也是最有效的提高轉(zhuǎn)化效率的方法。2008年Kim等[45]發(fā)現(xiàn):D-阿洛酮糖與硼酸在堿性條件下形成復合物的能力高于D-果糖,且該復合物不參與D-果糖與D-阿洛酮糖之間的異構(gòu)化反應,可在反應混合物中加入部分硼酸，打破反應平衡,使得異構(gòu)化反應逐漸向D-阿洛酮糖方向進行,進而提高D-阿洛酮糖的產(chǎn)量;在D-果糖與D-阿洛酮糖的反應體系中加入摩爾比例為60%的硼酸可使D-阿洛酮糖的產(chǎn)量達到最高,約為未加硼酸體系的2倍。

向反應混合物中加入硼酸,在一定程度上可以促進反應向阿洛酮糖生成的方向進行,由于硼酸具有毒性,故通過該方法獲得的阿洛酮糖在食品中的應用可能會受到一定的阻力。近些年來有研究者發(fā)現(xiàn)L-鼠李樹膠糖激酶(L-rhamnulose kinase,RhaB)可催化D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖-1-磷酸[46],且該反應為不可逆反應,因此將RhaB與DTE一起使用,可以打破異構(gòu)化反應的平衡點,進而提高D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率。溫俊婷等[47]將DPE與RhaB偶聯(lián),利用RhaB消耗一分子ATP將DPE反應產(chǎn)生的D-阿洛酮糖磷酸化,后者再通過酸性磷酸酶(Acid phosphatase,AP)將D-阿洛酮糖-1-磷酸脫磷酸為D-阿洛酮糖,以5 g/L果糖為底物,pH 8.5,35 ℃條件下偶聯(lián)體系反應轉(zhuǎn)化率可達70%。

D-阿洛酮糖磷酸化過程需要消耗一分子ATP,如沒有額外的ATP補充,則反應難以進行。多聚磷酸鹽激酶(Polyphosphate kinase,PPK)可用于ATP的重生,該酶可分為PPK1和PPK2。PPK1能以ATP為底物合成多聚磷酸鹽(PolyPn),也可以在ATP/ADP值偏低時,催化ADP轉(zhuǎn)化為ATP,PPK2更傾向于PolyPn的分解生成ATP。溫俊婷等[47]嘗試將DTE,RhaB和PPK1組成偶聯(lián)體系,相同條件下該偶聯(lián)體系反應轉(zhuǎn)化率降至50%,但ATP消耗降低至原來的1/5。馮林雪[48]則在大腸桿菌中異源表達DPE,RhaB和PPK2,此偶聯(lián)體系需要在D-阿洛酮糖生產(chǎn)過程中補加PolyPn保證ATP的充足供應,全細胞催化條件下以40 g/L的D-果糖為底物,反應8 h后阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率可達65%。相較于添加硼酸,使用生物酶手段提高異構(gòu)化效率的方法不僅更為安全可靠,而且有利于D-阿洛酮糖在食品領(lǐng)域的應用。

2.2 氧化阿洛醇產(chǎn)D-阿洛酮糖

除了通過異構(gòu)化反應生產(chǎn)阿洛酮糖外,氧化還原也可用于阿洛酮糖的生產(chǎn),且氧化還原方法生產(chǎn)阿洛酮糖具有較高的轉(zhuǎn)化率。Wen等[49]在大腸桿菌中異源表達來GluconobacterfrateuriiNBRC 3264的NAD(P)-依賴型醇脫氫酶[NAD(P)-dependent alcohol dehydrogenase,ADH],該酶在濃度為0.05 mol/L的阿洛醇底物下,pH 7,50 ℃條件下反應4 h,最終所得D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為97%,利用ADH氧化阿洛醇產(chǎn)D-阿洛酮糖的途徑如圖2所示。另外,Wen等[49]以該工程菌為生物催化劑,分別以10 g/L和100 g/L的阿洛醇為底物,在pH 10,50 ℃條件下以全細胞催化的方式進行D-阿洛酮糖的生產(chǎn),D-阿洛酮糖的最終轉(zhuǎn)化率分別為80.9%，48%。由此可以看出:通過ADH催化阿洛醇生產(chǎn)D-阿洛酮糖不僅可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率,而且也有利于D-阿洛酮糖后續(xù)的分離純化[49]。該方法中的底物阿洛醇也是一種稀有糖醇,目前尚未見其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的相關(guān)報道,由于阿洛醇價格高昂,目前來看以其為原料生產(chǎn)D-阿洛酮糖得不償失。

圖2 氧化阿洛醇產(chǎn)D-阿洛酮糖

2.3 葡萄糖直接轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖

D-果糖作為D-阿洛酮糖的主要生產(chǎn)原料,可由葡萄糖經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose isomerase,GI)或木糖異構(gòu)酶(Xylose isomerase,XI)催化得到。與葡萄糖相比,D-果糖的市場價格遠高于葡萄糖,若以葡萄糖為原料進行D-阿洛酮糖的生產(chǎn)可極大程度地降低D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本。日本香川大學的研究人員率先以固定化DTE與XI偶聯(lián)的方式進行D-葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的實驗,僅有10%的葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖[1]。隨后Zhang等[50]在E.coliBL21(DE3)菌株中同時表達了Acidothermuscellulolyticus11B的GI酶和Doreasp. CAG317的DPE,該工程菌以葡萄糖為原料,先催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖,隨后在其分泌的DPE作用下,將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖,葡萄糖直接轉(zhuǎn)化獲得D-阿洛酮糖的途徑如圖3所示。該共表達體系在pH 6.5,75 ℃時表現(xiàn)出最大的催化活性,當添加500 g/L的D-葡萄糖為底物時,可產(chǎn)生204.3 g/L的D-果糖和89.1 g/L的D-阿洛酮糖,約有17.8%的葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。Li等[51]通過兩步法由葡萄糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖,首先在大腸桿菌中表達XI,以此工程菌株催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖,然后將反應混合物的上清液倒入含DPE的酵母孢子中,60 ℃反應,實現(xiàn)將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖,該方法的D-阿洛酮糖最高轉(zhuǎn)化率可達12%。

圖3 葡萄糖直接生產(chǎn)D-阿洛酮糖

雖然以上方法均達到了由葡萄糖直接生產(chǎn)D-阿洛酮糖的目的,并在一定程度上降低了D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本,但是當以D-葡萄糖為基礎(chǔ)原料時,無論是一步法還是兩步法生產(chǎn)阿洛酮糖,D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率均低于20%,產(chǎn)量偏低。造成D-阿洛酮糖低轉(zhuǎn)化率的原因:1) 反應受熱力平衡的限制;2) 胞外多酶催化反應中所有酶均處于同一環(huán)境中,而不同酶的最適反應條件難以統(tǒng)一,很難充分發(fā)揮每一種酶的最高催化活性。此外,在由葡萄糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的過程中,GI(XI)催化葡萄糖異構(gòu)化為D-果糖的效率一般≥50%,而由DTE催化的D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖效率一般約為30%,由此可見由葡萄糖直接轉(zhuǎn)化獲得D-阿洛酮糖這一過程的限速酶為DTE,因此若要提升以葡萄糖為原料生產(chǎn)D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化效率,仍然需要在提升DTE性能方面進一步研究。

3 阿洛酮糖的分離純化

D-果糖到D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化是可逆反應,在最終達到反應平衡后,D-果糖依舊大量存在。由于生產(chǎn)D-阿洛酮糖的底物D-果糖與D-阿洛酮糖的性質(zhì)極為接近,使得D-阿洛酮糖的分離純化極為困難,從而制約D-阿洛酮糖的規(guī)模化生產(chǎn)。因此,開發(fā)簡單有效的分離方法在D-阿洛酮糖的實現(xiàn)工業(yè)化方面變得極為重要。目前分離阿洛酮糖的方法主要有:1) 利用模擬移動床技術(shù)分離;2) 利用生物轉(zhuǎn)化法分離。

3.1 模擬移動床色譜技術(shù)(SMB)純化分離D-阿洛酮糖

模擬移動床色譜技術(shù)(Simulated chromatographic moving bed technology,SMB)是利用各組分在固定相和流動相中吸附和分配系數(shù)的微小差異,實現(xiàn)各組分彼此分離的連續(xù)色譜技術(shù)。模擬移動床來源于移動床色譜分離技術(shù),在移動床色譜分離中,固定相在重力作用下自上而下運動,流動相在泵機的作用下由下向上運動,兩者形成逆流并進行各自的循環(huán),將固定相的移動速率設(shè)置在兩種目的樣品遷移速率之間,可以在不同出口連續(xù)得到兩種目的樣品[52-53]。固定相和流動相的連續(xù)流動會導致固定相材料的磨損,磨損的殘渣會造成管道和閥門的堵塞,影響系統(tǒng)的穩(wěn)定性,這些問題使得移動床色譜技術(shù)在實際運行中難以達到理想狀態(tài)。

SMB技術(shù)使用裝填于色譜柱中的靜止分離介質(zhì),其色譜柱首尾連接成環(huán),不斷改變洗脫液入口和出口位置,使色譜柱發(fā)生相對運動[53]。周錦怡等[54]通過單柱實驗篩選用于SMB分離D-果糖與D-阿洛酮糖的固定相,經(jīng)過考察D-阿洛酮糖在不同類型樹脂上的保留行為及分離效果,確定了Ca2+型樹脂為適宜的固定相。Nguyen等[55]以Dowex50WX4-Ca2+離子交換樹脂為固定相以模擬SMB過程,結(jié)果顯示D-阿洛酮糖的純度和收率分別為99.04%和97.46%,殘液(D-果糖)的純度和收率分別為99.06%和99.53%,D-阿洛酮糖和D-果糖都取得了較好的分離效果。Li等[31]使用Ca2+型固定相,以去離子水為洗脫劑,分離果糖與D-阿洛酮糖,經(jīng)SMB分離后D-阿洛酮糖純度可達98.5%。使用SMB進行D-阿洛酮糖產(chǎn)物的分離是一種高效的分離方法,不僅可以獲得高純度的D-阿洛酮糖,而且還可以分離出未反應的果糖或其他糖類,這些糖類還可繼續(xù)用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn),殘余糖利用率高,節(jié)省了大量生產(chǎn)成本,隨著產(chǎn)量的增加,這種成本優(yōu)勢會愈發(fā)明顯,非常適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 生物法分離純化阿洛酮糖

雖然使用SMB分離方法可以將D-果糖與D-阿洛酮糖從反應液中分離出來,但是其設(shè)備投資較高、技術(shù)復雜,更適合大規(guī)模生產(chǎn)企業(yè)的應用。由于異構(gòu)化反應中主要目的產(chǎn)物是D-阿洛酮糖,故可以考慮先將殘余果糖轉(zhuǎn)化為其他易于與D-阿洛酮糖分離的物質(zhì),再進行D-阿洛酮糖的分離純化,目前常使用生物催化劑將剩余果糖進行轉(zhuǎn)化。姜彥君等[56]在果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖后,將混合糖液中的D-果糖作為底物進行釀酒酵母的好氧發(fā)酵,24 h后D-果糖被大量消耗,果糖去除率達94.22%,該過程雖然去除了大量果糖,但是未能產(chǎn)生其他有價值的產(chǎn)品,經(jīng)濟損失較大。袁堂國等[40]利用馬克斯克魯維酵母將未轉(zhuǎn)化的果糖經(jīng)無氧發(fā)酵后生成乙醇,將乙醇回收用作燃料,既減少了混合糖液中果糖的質(zhì)量分數(shù),降低了D-阿洛酮糖的分離難度,又能盡可能利用殘余果糖。李燦[38]使用固定化GI先將反應殘液中的D-果糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖,然后利用固定化葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)將生成的葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸,最后利用陰離子交換樹脂吸附葡萄醛酸,并將葡萄醛酸回收利用,得到高質(zhì)量濃度的D-阿洛酮糖溶液,最終D-阿洛酮糖的純度達到91.2%,該方法不僅得到較高質(zhì)量濃度的D-阿洛酮糖溶液,還能盡可能地對殘余果糖進行回收,具有一定的工業(yè)化生產(chǎn)意義。

雖然以上方法降低了D-阿洛酮糖的分離難度,操作方法也較為簡單,但是也降低了底物(如D-果糖)的利用率。生物法分離純化D-阿洛酮糖存在以下劣勢:1) 由于將其他菌株引入了發(fā)酵反應液,故難免會產(chǎn)生其他代謝廢物,對以全細胞催化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的工藝來說存在雜菌污染的風險;2) 反應液發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇質(zhì)量濃度低,將乙醇進行濃縮精餾也會帶來額外的成本投入。因此,生物法分離純化D-阿洛酮糖能否應用于工業(yè)化生產(chǎn)還有待商榷。生物法分離純化D-阿洛酮糖的優(yōu)勢在于不僅不需要額外的設(shè)備投入,成本較低,而且操作方法簡單有效,非常適合實驗室研究?？傊?兩種D-阿洛酮糖分離純化方法都可以取得良好的分離效果,有各自的適用環(huán)境,具體采用哪一種,可根據(jù)實際情況進行選擇。

3.3 D-阿洛酮糖結(jié)晶

結(jié)晶是D-阿洛酮糖生產(chǎn)的最后一步,關(guān)系著最終產(chǎn)品的質(zhì)量優(yōu)劣和經(jīng)濟效益。在工業(yè)生產(chǎn)中最常用的結(jié)晶方法有蒸發(fā)法、降溫法、真空冷卻法和有機溶劑析出法等。由于D-阿洛酮糖在高溫下會變色,并且其溶解度會隨著溫度變化而發(fā)生較大變化,因此D-阿洛酮糖常采用降溫法進行結(jié)晶。此外,D-阿洛酮糖在有機溶劑中溶解度較低,也可采用有機溶劑析出法進行阿洛酮糖的結(jié)晶。

李燦[38]將模擬移動床分離得到的D-阿洛酮糖溶液濃縮,得到糖度為60,70,75,80的糖溶液,分別加入0.1%的400目的D-阿洛酮糖晶種,由65 ℃降溫至4 ℃結(jié)晶,發(fā)現(xiàn)當糖度>75后加入晶種才能結(jié)晶,此方法的結(jié)晶率可達80%。趙哲衛(wèi)等[57]先在D-阿洛酮糖濃縮液(質(zhì)量分數(shù)≥85%)中加入晶種,在50～30 ℃溫度區(qū)間內(nèi)交替進行梯度降溫和恒溫結(jié)晶,當糖液溫度為30 ℃停止結(jié)晶,結(jié)晶收率≥70%。采用降溫結(jié)晶法對D-阿洛酮糖進行結(jié)晶,對設(shè)備要求低、工藝簡單,便于實際生產(chǎn),尤其適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)加工。

有機溶劑析出法常用的析出劑是乙醇,乙醇與水分子的親和力大于D-阿洛酮糖和水分子的親和力,乙醇的加入可以將D-阿洛酮糖和水分子有效分離,從而促進D-阿洛酮糖析出晶體。佟毅等[58]開發(fā)了一種利用乙醇析出D-阿洛酮糖結(jié)晶的方法,在濃縮后的D-阿洛酮糖溶液中加入少量乙醇,再次濃縮,乙醇帶走D-阿洛酮糖溶液中的水分,得到D-阿洛酮糖乙醇濃縮液,重復此步驟2～3次即可得到D-阿洛酮糖晶體。該方法一次結(jié)晶率高于50%,易于固液分離。郭元亨等[59]通過調(diào)節(jié)結(jié)晶過程中糖溶液密度、乙醇與糖液質(zhì)量比、結(jié)晶時間和結(jié)晶溫度來改進結(jié)晶工藝,認為:1) 糖液質(zhì)量濃度應控制在1.35 g/L以下,過高的糖液密度會降低液體傳熱性能,易發(fā)生美拉德反應,影響產(chǎn)品品質(zhì);2) 乙醇與糖液質(zhì)量比為3.8∶1,當乙醇加入量過高時部分D-阿洛酮糖會溶于乙醇,降低結(jié)晶率;3) 結(jié)晶時間宜低于5 h,結(jié)晶溫度宜控制在25 ℃以下,此方法可盡量降低生產(chǎn)成本,結(jié)晶率可達71.58%。由于乙醇是易燃品,因此對結(jié)晶過程提出了更高的要求,在使用過程中乙醇需要回收,增加了成本。相較于降溫結(jié)晶法,有機溶劑析出法中需要的D-阿洛酮糖濃縮液質(zhì)量濃度低,不需要額外的濃縮步驟,因此在實際應用也具有一定的優(yōu)勢,生產(chǎn)者可根據(jù)濃縮液濃度或自身實際情況選擇結(jié)晶方式。

4 結(jié) 論

作為一種高甜度、低熱量的新型甜味劑,D-阿洛酮糖在食品領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。雖然在生物合成和分離純化領(lǐng)域都已建立了比較系統(tǒng)的D-阿洛酮糖生產(chǎn)工藝,但是其在生物合成法方面還有較大的改進空間。筆者認為當前對D-阿洛酮糖的生物合成研究需要聚焦于2個方面:1) 繼續(xù)提升DTE家族催化能力,提高D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率，增強酶的穩(wěn)定性,提高酶的重復利用率，改善各種酶的催化環(huán)境,如降低DTE最適pH,減少褐變反應的發(fā)生等;2) 以全細胞催化的方式生產(chǎn)D-阿洛酮糖或?qū)⒊蔀橹髁?構(gòu)建重組食品安全菌株成為必需。隨著越來越多國家通過對D-阿洛酮糖食品級應用的批準,D-阿洛酮糖的市場將保持快速增長,其在食品領(lǐng)域中的應用也將得到不斷拓展。