(中檢科健(天津)檢驗(yàn)檢測有限責(zé)任公司,天津 300309)

藤茶即顯齒蛇葡萄,是葡萄科蛇葡萄屬植物[1-2]。二氫楊梅素(3,5,7,3′,4′,5′-六羥基-2,3-雙氫黃酮醇,Dihydromyricetin)是一種黃酮類化合物,又名雙氫楊梅樹皮素、白蘞素[3],廣泛存在于蛇葡萄科植物中,在藤茶中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)30%[4],在1940年首次被發(fā)現(xiàn),可從藤茶莖和葉中分離得到[5]。有研究[6-11]證實(shí)二氫楊梅素可清除自由基、調(diào)節(jié)血脂,改善腸道菌群,解除酒精中毒,具有預(yù)防酒精肝、脂肪肝和抗腫瘤等作用,在食品工業(yè)中應(yīng)用較為廣泛,極具開發(fā)利用價(jià)值。在開發(fā)利用二氫楊梅素時(shí),需要關(guān)注生物活性物質(zhì)的安全性。目前對二氫楊梅素毒理學(xué)安全性研究僅見急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)報(bào)道[12-15],以大鼠為實(shí)驗(yàn)條件開展的急性毒性實(shí)驗(yàn)[16],二氫楊梅素服用劑量為5 g/kg,14 d內(nèi)口服灌胃喂養(yǎng),實(shí)驗(yàn)結(jié)束全部大鼠均存活,表明二氫楊梅素的毒性作用很小。目前,國內(nèi)外尚未見重復(fù)劑量經(jīng)口實(shí)驗(yàn)的毒理學(xué)研究,為評價(jià)二氫楊梅素亞急性經(jīng)口毒性,筆者按照GB 15193.22—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)28天經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)》方法對其開展研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

二氫楊梅素(CAS號:27200-12-0),西安天豐生物科技股份有限公司,批號:NF-20190314,純度>98%;生化診斷試劑盒,九強(qiáng)生物公司;血液學(xué)試劑包、染液、凝血酶原時(shí)間測試板、活化部分凝血激酶時(shí)間測試板,美國愛德士公司;尿液分析試紙條,德國西門子公司。

1.2 儀 器

ProCyte Dx血液分析儀、Coag Dx血凝分析儀,美國愛德士公司;7100型全自動生化研究儀,日本日立(HITACHI)公司;RM2235切片機(jī),德國徠卡(Leica)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)共使用100只SPF級SD大鼠,雌雄各半,購入時(shí)4～5周齡,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016—0006,動物質(zhì)量合格證號:1100111911051485(雌),1100111911051486(雄)。動物飼養(yǎng)設(shè)施使用許可證號:SYXK(津)2018—0002,實(shí)驗(yàn)期間動物設(shè)施環(huán)境溫度為20～25.8 ℃,日溫差<3.8 ℃,相對濕度為32.7%～70.1%,換氣頻率>15次/h,照明時(shí)間為12 h(07:00—19:00)[17]。動物飼養(yǎng)于聚碳酸酯鼠盒,底鋪高壓蒸汽滅菌的小刨花墊料,每籠5只,每周換籠2次。鼠顆粒飼料,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019—0008。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物處置

動物購入后適應(yīng)5 d,分成6組:對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、附加對照組和附加高劑量組,其中對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組每組雌、雄大鼠各10只,附加對照組和附加高劑量組每組雌、雄大鼠各5只[18-19]。連續(xù)28 d經(jīng)口給予對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠的實(shí)驗(yàn)樣品二氫楊梅素服用劑量分別為0,1 250,2 500,5 000 mg/kg(飼料摻入法,實(shí)驗(yàn)樣品摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%,1.25%,2.5%,5%)。觀測各組大鼠的中毒體征、食物利用率、血液學(xué)、血凝學(xué)、血生化和電解質(zhì)、尿液、臟器質(zhì)量、臟器質(zhì)量體重比及病理學(xué)改變。附加對照組和附加高劑量組動物在染毒停止后繼續(xù)恢復(fù)期觀察14 d,觀察毒性反應(yīng)的可恢復(fù)性、持續(xù)性和遲發(fā)性毒性效應(yīng)[20-21]。

1.4.2 生物樣本采集

1) 血液樣本采集:28 d染毒或14 d恢復(fù)期結(jié)束后,動物禁食過夜,自由飲水,腹腔注射4.5%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉(服用劑量為45 mg/kg),腹主動脈采血。乙二胺四乙酸抗凝血用于血液學(xué)檢測,枸櫞酸鈉抗凝血用于血凝學(xué)檢測,血清用于血清生化和電解質(zhì)測定。

2) 組織樣本采集:28 d染毒或14 d恢復(fù)期結(jié)束時(shí),解剖采集腦、胰、甲狀腺、卵巢、心臟、肝、脾、腎、睪丸、腎上腺、胃、十二指腸、結(jié)腸、腸系膜淋巴結(jié)、胸腺和膀胱組織樣本。

1.4.3 觀測指標(biāo)

1) 一般觀察:每日觀察動物體征1次,每周稱體重及攝食量,計(jì)算食物利用率,即動物每食入100 g食物所增長的體重。

2) 尿液檢查:在染毒的第26～27 d和恢復(fù)期的第12～13 d進(jìn)行尿液檢查。用大鼠代謝籠收集4 h內(nèi)新鮮尿液,使用尿液分析試紙檢測尿液常規(guī)10項(xiàng)指標(biāo):比重、糖、膽原、蛋白、隱血、膽紅素、pH、白細(xì)胞、酮體和亞硝酸鹽。

3) 血液學(xué)和血凝學(xué)檢測:血液學(xué)指標(biāo)白細(xì)胞數(shù)(WBC)、白細(xì)胞五分類計(jì)數(shù)、血小板數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白質(zhì)量濃度(HGB)、紅細(xì)胞比容(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白質(zhì)量(MCH)和平均紅細(xì)胞血紅蛋白質(zhì)量濃度(MCHC)。血凝學(xué)指標(biāo)凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血激酶時(shí)間(APTT)[22]。

4) 生化系列血清和電解質(zhì)檢測:甘油三酯、白蛋白、總膽固醇、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、葡萄糖、堿性磷酸酶、鈉、尿素、鉀、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、肌酐、氯和總蛋白質(zhì)。

5) 臟器質(zhì)量和臟器系數(shù):稱心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮(帶宮頸)和卵巢(帶輸卵管)質(zhì)量,臟器系數(shù)為計(jì)算臟器質(zhì)量與大鼠體重之比[23-24]。

6) 病理檢查:對腦、甲狀腺、胸腺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、結(jié)腸、胰、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、睪丸和膀胱進(jìn)行大體剖檢,制備病理切片,進(jìn)行組織病理學(xué)顯微鏡下檢查[25-26]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對多水平數(shù)據(jù)采用單因素方差法分析檢驗(yàn)組間差異[27-28],以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。若組間有顯著性差異,則進(jìn)行兩兩比較;若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布,則采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析(Kruskal-wallis檢驗(yàn))。附加對照組與附加高劑量組采用t檢驗(yàn)法比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床體征觀察

大鼠連續(xù)染毒28 d,所有染毒動物均未死亡,所有染毒動物在整個(gè)染毒期均未觀察到毒性體征。當(dāng)恢復(fù)期為14 d時(shí),未觀察到附加高劑量組動物出現(xiàn)異常表現(xiàn)。

2.2 攝食質(zhì)量和體重檢測

與對照組相比,各劑量組大鼠攝食量未發(fā)生明顯改變。通過飼料摻入的方法進(jìn)行受試物的給予,不影響動物正常的攝食。

染毒期間,僅在第3周高劑量組雄鼠體重與對照組相比顯著降低(P<0.05);恢復(fù)期間,附加高劑量組大鼠體重與附加對照組相比均無顯著差異(P>0.05);與對照組相比,各劑量組大鼠食物利用率未明顯受到染毒影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒對大鼠體重和攝食量的增長無明顯影響。

2.3 尿液檢測

與對照組相比,各劑量組尿液密度未發(fā)生顯著改變,其他指標(biāo)結(jié)果:pH均為5～7，蛋白、糖、酮體、膽紅素、膽原、隱血、白細(xì)胞均和亞硝酸鹽均為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒對尿液常規(guī)指標(biāo)無明顯影響。

2.4 血液學(xué)和血凝學(xué)檢測

二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒大鼠血凝學(xué)檢測結(jié)果與對照組相比,各劑量組未發(fā)生顯著改變;血液學(xué)檢測結(jié)果與對照組相比,各劑量組PLC、WBC和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)均無顯著改變(結(jié)果未列表)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:在實(shí)驗(yàn)劑量允許范圍內(nèi),二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒對大鼠血液凝固、白細(xì)胞和血小板均無明顯影響。

表1 RBC、HGB和HCT的檢測結(jié)果

可以通過血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)中反映紅細(xì)胞大小和血紅蛋白質(zhì)量濃度的參數(shù)值判斷貧血類型。1929年Wintrobe首次應(yīng)用MCV、MCH和MCHC來描述紅細(xì)胞大小和HGB[29],通過檢測獲得RBC、HCT和HGB,計(jì)算得到:MCV=HCT/RBC,MCH=HGB/RBC,MCHC=HGB/HCT。根據(jù)紅細(xì)胞體積將貧血分為正細(xì)胞性貧血、大細(xì)胞性貧血和小細(xì)胞性貧血[30],根據(jù)紅細(xì)胞血紅蛋白質(zhì)量濃度將貧血分為正色素性貧血、高色素性貧血和低色素性貧血,從而有助于推斷可能的病因?qū)W機(jī)制[31]。研究結(jié)果表明:二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒各劑量組大鼠的此3項(xiàng)指標(biāo)均與對照組無顯著差異,提示二氫楊梅素導(dǎo)致大鼠貧血分類為正細(xì)胞正色素性貧血;從外源化學(xué)物質(zhì)的作用機(jī)制看,正細(xì)胞性貧血主要見于急性失血性貧血、溶血性貧血和部分再生障礙性貧血[32],二氫楊梅素造成的紅細(xì)胞推測可能是溶血性貧血,即紅細(xì)胞遭破壞導(dǎo)致數(shù)量減少。Chen等[33]雖然報(bào)道了二氫楊梅素可與人血紅蛋白直接結(jié)合,但是更深入的機(jī)制未涉及。

表2 MCV、MCH和MCHC檢測結(jié)果

2.5 血清生化和電解質(zhì)檢測

表3 血清生物化學(xué)檢測結(jié)果

由表3可知:與對照組相比,各劑量組血清電解質(zhì)指標(biāo)未發(fā)生顯著改變,生化指標(biāo)個(gè)別劑量組有顯著差異。在各劑量組雌大鼠28 d染毒期末,高劑量組血清葡萄糖(GLU)的測定值有顯著差異(P<0.001),中劑量組血漿總蛋白(TP)與白蛋白(ALB)的測定值均有顯著差異(P<0.001),低劑量組血清總膽固醇(TCHO)的測定值有顯著差異(P<0.05)。與對照組比較,在各劑量組雄大鼠28 d染毒期末,高劑量組TP與ALB的測定值均有顯著差異(P<0.05),中劑量組TCHO的測定值有顯著差異(P<0.001)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室歷史對照數(shù)據(jù)比對和劑量—效應(yīng)關(guān)系分析,血清生物化學(xué)指標(biāo)的改變和給樣不具有給樣相關(guān)性。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,筆者認(rèn)為二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒雖然對大鼠血清生物化學(xué)和電解質(zhì)檢測無明確毒理學(xué)意義的影響,但是不排除在一定條件下二氫楊梅素可能影響大鼠對糖、脂和蛋白質(zhì)等的物質(zhì)代謝,故在對二氫楊梅素降糖、降血脂保健功能的研發(fā)中,其自身對糖、脂代謝的影響應(yīng)引起關(guān)注。

2.6 臟器質(zhì)量與臟器體重比

考察二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒大鼠臟器質(zhì)量,包括稱心臟、胸腺、腎臟、睪丸、脾臟、附睪、肝臟、子宮(帶宮頸)和卵巢(帶輸卵管)質(zhì)量、腎上腺和臟器系數(shù)比,未發(fā)現(xiàn)染毒相關(guān)臟器質(zhì)量與臟器體重比發(fā)生顯著改變。

2.7 病理學(xué)檢查結(jié)果

對二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒大鼠進(jìn)行大體剖檢和組織病理學(xué)檢查,用肉眼觀察各劑量組雄性與雌性大鼠的主要臟器大體形態(tài),未見明顯染毒相關(guān)的異常改變;將高劑量組和對照組在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察,在高劑量組中未發(fā)現(xiàn)有與實(shí)驗(yàn)樣品明顯相關(guān)的特異性改變。

3 結(jié) 論

在筆者設(shè)置的6組研究條件下,二氫楊梅素28 d經(jīng)口染毒性對SD大鼠未觀察到有害作用每天劑量NOAEL:雌性大鼠為1 250 mg/kg,雄性大鼠為2 500 mg/kg;最小觀察到有害作用每天劑量LOAEL:雌性大鼠為2 500 mg/kg,雄性大鼠為5 000 mg/kg。附加高劑量組停止染毒后觀察14 d,其毒性效應(yīng)可以恢復(fù)。該研究在國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素亞急性經(jīng)口攝入導(dǎo)致紅細(xì)胞生成損害,提示紅細(xì)胞系統(tǒng)可能是長期攝入二氫楊梅素的毒作用靶點(diǎn),應(yīng)引起保健食品研發(fā)者的關(guān)注。