李輝，王娟，袁新華

湖州市婦幼保健院 兒科，浙江 湖州 313000

功能性便秘（functional constipation, FC）是指除外腸道或全身器質(zhì)性疾病及藥物性因素所引起的便秘，占兒童便秘的90%～95%，是兒童常見的功能性胃腸道疾病。目前全球兒童FC患病率為 9.5%，但4歲以下兒童的患病率更高，為17.5%[1]。FC在臨床表現(xiàn)上主要為排便費(fèi)力、排干硬便、排便不盡感，排便時肛門直腸堵塞感等。長期便秘嚴(yán)重影響兒童身心健康，尤其對于嬰幼兒，影響其生長發(fā)育，并給患兒家長帶來了沉重心理負(fù)擔(dān)[2]。FC的發(fā)病病理生理機(jī)制復(fù)雜，目前確切病因尚未明確，可能與遺傳、飲食、代謝、精神、腸道菌群等因素有關(guān)。隨著核酸技術(shù)發(fā)展，16S rDNA序列測定可被用于細(xì)菌的分型鑒定，以及發(fā)現(xiàn)和描述新的細(xì)菌種類，因而被廣泛用于腸道菌群的研究。本研究通過16S rDNA測序?qū)?～3歲患有FC嬰幼兒的腸道菌群進(jìn)行研究，分析其菌群結(jié)構(gòu)以及潛在的細(xì)菌生物標(biāo)志物，旨在為指導(dǎo)臨床干預(yù)與治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至12月在湖州市婦幼保健院門診就診的0～3歲FC患兒17例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2016年兒童功能性胃腸病羅馬IV診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，年齡＜4歲的兒童至少符合以下條件中2項，持續(xù)時間達(dá)1個月：①每周排便≤2次；②大量糞便潴留史；③有排便疼痛和排便費(fèi)力史；④排粗大糞便史；⑤直腸內(nèi)存在大量糞便團(tuán)塊；⑥接受排便訓(xùn)練，能控制排便后每周至少出現(xiàn)1次大便失禁；⑦粗大糞便曾堵塞抽水馬桶。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有嚴(yán)重的先天性畸形者；②合并有嚴(yán)重的惡性腫瘤者；③伴有嚴(yán)重血液性疾病者；④有消化道疾病及手術(shù)史；⑤甲狀腺功能減低等內(nèi)分泌疾病史；⑥1周內(nèi)曾使用抗生素、粗纖維、多糖類食物及益生菌等微生態(tài)藥物者。同期選取納入兒?？瞥Ｒ?guī)體檢及系統(tǒng)管理的排便正常的0～3歲嬰幼兒15例做為對照組?；純杭覍倬栽竻⒓硬⒑炇鹬橥鈺?。本研究通過湖州市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2018-R-007）。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器：包括Eppendorf Centrifuge 5424的常溫離心機(jī)，Microfuge R 22RCentrifuge的冷凍離心機(jī)，上海華利達(dá)公司W(wǎng)H-861 Vortex Shaker的旋渦震蕩儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司A200基因擴(kuò)增儀以及上海天能公司REPS300的電泳儀等。

1.2.2 主要試劑：包括上海儀濤生物儀器有限公司生產(chǎn)的貨號為M0536L的Pusion Hot start flex 2X Master Mix，日本Takara公司生產(chǎn)的貨號為3427A的DL2000 DNA Maker，美國Life Technologies 公司生產(chǎn)的貨號為Q32854的Qubit dsDNA HS Assay Kit（500次）以及北京金博益生產(chǎn)的貨號為GBY-1的Gene colour等。

1.3 方法

1.3.1 糞便標(biāo)本采集：采用無菌棉簽，于清晨采集研究對象的糞便，并將排出的糞便立即置于密閉避光的糞便儲存器內(nèi)作為糞便標(biāo)本待檢測，隨機(jī)標(biāo)記后迅速將裝有糞便標(biāo)本的糞便儲存器置于-80 ℃的低溫冰箱內(nèi)保存待檢。

1.3.2 糞便標(biāo)本DNA提取與PCR擴(kuò)增：選擇E.Z.N.A.?Stool DNA Kit（杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司）分離試劑盒從糞便樣本中提取細(xì)菌全基因組DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，同時采用紫外分光光度計對DNA進(jìn)行定量。按說明書進(jìn)行操作，將細(xì)菌總DNA主帶完整無污染的樣本進(jìn)一步檢測。使用PCR擴(kuò)增引物：正向引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’），反向引物805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）；對細(xì)菌總DNA中16S（V3+V4）區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增建庫，以及使用PCR擴(kuò)增引物：正向引物F（5’-GTGARTCATCGAATCTTTG-3’），反向引物R（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），對細(xì)菌總DNA中ITS2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增建庫。

1.3.3 文庫制備及基因測序：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過 2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收采用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒。純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Qbit熒光定量系統(tǒng)上對文庫進(jìn)行定量，合格的文庫濃度應(yīng)在2 nmol/L以上。將合格的上機(jī)測序文庫（Index 序列不可重復(fù)）梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測序，使用NovaSeq測序儀進(jìn)行2×250 bp的雙端測序。PCR反應(yīng)成分和體積包括Phusion Hot start flex 2X Master Mix， 12.5 μL；Forward Primer 2.5 μL；Reverse Primer 2.5 μL；Template DNA 50 ng；Add ddH2O 25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃溫度下預(yù)變性30 s以及10 s，再進(jìn)行30個循環(huán)，每一循環(huán)的過程在54 ℃環(huán)境下進(jìn)行30 s的變性，最后在72 ℃的環(huán)境下進(jìn)行45 s以及10 min的變性，并在4 ℃環(huán)境下退火。

1.3.4 生物分析流程：通過cutadapt1.9軟件對數(shù)據(jù)預(yù)處理，將測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)處理，保證后續(xù)信息分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；使用FLASH軟件對16S（V3+V4）擴(kuò)增區(qū)和PEAR軟件對ITS2擴(kuò)增區(qū)雙端拼接，將雙端數(shù)據(jù)合并成一條長的擴(kuò)增子片段；利用qiime2 DADA2軟件進(jìn)行降噪，獲得ASV（feature）特征序列和ASV（feature）豐度表格，并去除singletons ASVs，基于得到的ASV（feature） 特征序列和ASV（feature）豐度表格進(jìn)行Alpha多樣性分析和betau多樣性分析。其中Alpha多樣性分析主要通observed_species、shannon、simpson、chao1、goods_coverage、pielou_e七大指數(shù)對生境內(nèi)的多樣性進(jìn)行評估。Beta多樣主要通過計算四種距離（weighted_unifrac、unweighted Unifrac、 jaccard、bray_curtis），采用六大分析對生境間（樣本/分組間）的多樣性進(jìn)行評估分析。根據(jù)ASV（feature）序列文件采用SILVA（Release 138）數(shù)據(jù)庫以NT-16S數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，并根據(jù)ASV（feature）豐度表對各物種在各樣本中的豐度進(jìn)行統(tǒng)計?；诘玫降奈锓N豐度統(tǒng)計信息，進(jìn)行2組之間的差異分析。LEfSe（LDA effect size）分析是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識的分析工具，利用LEfSe（LDA effect size）分析在組與組之間尋找豐度具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)識。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，采用t檢驗，非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以[例（%）]表示，2組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組的一般資料比較 2組年齡、體質(zhì)量、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 2組一般資料比較

2.2 Alpha多樣性分析結(jié)果 通過計算observed_species、shannon、simpson、chao1和goods_ coverage指數(shù)的分析方法進(jìn)行Alpha多樣性分析，2組Chao1指數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027），見圖1A，表明便秘兒童的腸道菌群物種有很好的豐富度；2組Simpson指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.310），見圖1B，表明2組腸道菌群Alpha多樣性無顯著性差異。

圖1 2組菌群Alpha多樣性分析結(jié)果

2.3 Beta多樣性分析結(jié)果 采用PCoA分析方法對2組進(jìn)行Beta多樣性分析，基于unweighted UniFrac距離的Beta多樣性分析表明，2組的微生物組成是不同的，見圖2。進(jìn)行相似性分析，結(jié)果表明便秘組腸道微生物組的結(jié)構(gòu)與對照組顯著不同（r=0.158，P＜0.01）。

圖2 2組腸道菌群的Beta多樣性分析結(jié)果

2.4 菌群組成分析結(jié)果 從細(xì)菌“門”水平對兩組樣本進(jìn)行群落分析：便秘組豐度前3位的分別是放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門 （Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria），占比分別為46.7%、31.3%、13.58%；對照組豐度前3位的分別為放線菌門、厚壁菌門、變形菌門，占比分別為48.2%、23.9%、27.2%，見圖3。另外，疣微菌門 （Verrucomicrobia）在便秘組中豐度較多，占比為7.3%，而在對照組中極少，占比為0.003%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從細(xì)菌“屬”水平對兩組樣本進(jìn)行群落分析：便秘組豐度前5位的分別是雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬 （Streptococcus）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、 乳酸菌屬（Lactobacillus）、阿克曼菌屬 （Akkermansia），占比分別為43.9%、10.38%、8.2%、8.0%、7.3%；而對照組豐度前5位的分別是雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、伯克霍爾德菌屬、乳酸菌屬、阿克曼菌屬，占比分別為41.92%、11.65%、2.83%、0.87%、0.003%，見圖4；另外，乳酸菌屬和阿克曼菌屬在便秘組中豐度所占比明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 2組間腸道細(xì)菌“門”水平群落組成對比

圖4 2組間腸道細(xì)菌“屬”水平群落組成對比

2.5 腸道菌群LEfSe分析結(jié)果 LEfSe分析2組間豐度具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)識。便秘組中雙歧桿菌種HGAT9（Bifidobacterium_sp_HGAT9）、疣微菌門、阿克曼菌屬、副干酪乳桿菌（Lactobacillus_ paracasei）等物種豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組中齒雙歧桿菌（Bifidobacterium_sp_ dentium）、放線菌目（Actinomycetales）、放線菌科（Actinomycetaceae）、放線菌屬（Actinomyces）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus_rhamnosus）物種豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 2組的LEfSe分析圖

3 討論

便秘是臨床上常見的幼兒疾病，其中約有95%為FC。FC的病理生理機(jī)制復(fù)雜，目前確切病因尚未明確，臨床治療具有挑戰(zhàn)性。本研究基于16S rDNA測序分析FC兒童和正常兒童腸道菌群的組成，發(fā)現(xiàn)兩組兒童在腸道菌群的結(jié)構(gòu)及多樣性上存在差異，另外研究也發(fā)現(xiàn)了兩組腸道菌群的生物標(biāo)志物。

本研究的腸道菌群多樣性結(jié)果表明，便秘組兒童的腸道菌群物種豐富度增加，但兩組腸道菌群之間物種Alpha多樣性無顯著性差異，而Beta多樣性存在明顯差異，這表明便秘組的腸道微生物在結(jié)構(gòu)上與對照組有顯著不同，便秘與腸道菌群之間存在著相關(guān)性。目前有大量研究也證實了這一點[4-5]。本研究中腸道菌群構(gòu)成分析顯示便秘組兒童和對照組兒童在門水平上均以放線菌門、厚壁菌門、變形菌門為優(yōu)勢菌。兩組間的差異菌門為疣微菌門，便秘兒童腸道內(nèi)疣微菌門明顯高于對照組兒童。疣微菌門為腸道常見的微生物菌群，目前發(fā)現(xiàn)與多種疾病有關(guān)。有動物實驗發(fā)現(xiàn)用多菌株益生菌和合生元聯(lián)合給藥能顯著降低疣微菌門的數(shù)量，且減少疣微菌門的數(shù)量可能對便秘有緩解作用[6]。WANG等[7]在研究洛哌丁胺誘導(dǎo)的動物便秘時發(fā)現(xiàn)厚壁菌的相對豐度降低，而疣狀菌的相對豐度增加。這些說明疣微菌可能與便秘有關(guān)，但發(fā)生機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。在屬水平上，雙歧桿菌為兩組優(yōu)勢菌種，兩者所占比例相差不大，與國外的研究結(jié)果一致[4]。雙歧桿菌屬可以通過調(diào)節(jié)便秘患者血清中的胃腸調(diào)節(jié)肽水平，刺激腸道產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short chain fatty acids, SCFAs），另外還可促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生，降低腸道pH值，促進(jìn)腸道蠕動，改善便秘癥狀[8]。乳酸菌屬在便秘組中豐度高于對照組，這與國外的一些研究不一致[9]，考慮到本研究人群為0～3歲嬰幼兒，可能與乳酸菌屬早期在腸道定植不穩(wěn)定以及飲食對腸道菌群的調(diào)節(jié)有關(guān)[10]。乳酸菌具有較好的腸道保護(hù)作用，尤其是對有腸道癥狀的患兒，它通過合成SCFA、刺激腸道蠕動和增加糞便顆粒中的水分含量來緩解便秘[11]。LI等[12]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)給予乳桿菌NCU116可顯著改善小鼠便秘癥狀，并導(dǎo)致其糞便中乙酸和丙酸水平顯著升高。但另一項涉及129名FC兒童的隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)羅氏乳桿菌DSM 17 938對FC秘治療無效[13]。目前乳酸菌與便秘之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。另外本研究發(fā)現(xiàn)阿克曼菌屬在便秘組中豐度也高于對照組。阿克曼菌目前發(fā)現(xiàn)與肥胖、糖尿病、阿爾茨海默病等疾病有關(guān)。在國內(nèi)的一項動物實驗中發(fā)現(xiàn)便秘小鼠糞便微生物群中阿克曼菌屬豐度較高，但機(jī)制不明確，可能與其能降解腸黏蛋白，使大便干燥，最終導(dǎo)致腸黏膜屏障受損有關(guān)[14]。至今為止，很少有報道阿克曼菌屬與兒童便秘之間存在相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)阿克曼菌屬是具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)志物，這為未來研究其與便秘之間的關(guān)系提供了思路。

目前對于兒童腸道菌群的相關(guān)研究并不多見且研究結(jié)果不一，且尚未確定FC兒童的腸道微生物群特征。出現(xiàn)這些不同可能與以下因素有關(guān)：①不同的研究人群數(shù)量、年齡以及地區(qū)可能會影響實驗結(jié)果[13]；②檢測腸道菌群方法不同，不同研究結(jié)果之間的直接比較缺乏說服力[5]；③微生物分析通常在糞便樣本中進(jìn)行，然而，糞便中存在的微生物群可能與黏膜相關(guān)的微生物群存在差異[15]；④腸道微生物組分和便秘受飲食的影響很大，這也可能會影響研究之間的直接比較等。因此，未來的研究應(yīng)控制相關(guān)的混雜因素，并采用多組學(xué)研究策略對FC進(jìn)行微生物研究，有助于獲得更完整、更深入的結(jié)論。

綜上所述，0～3歲嬰幼兒FC與腸道菌群之間存在一定的關(guān)系，但FC的發(fā)病受飲食、地域、種族、年齡以及性別等諸多因素影響。本研究僅對嬰幼兒FC者進(jìn)行了糞菌檢測，且樣本量偏小，研究結(jié)果比較局限，未來仍需大量深入的研究來探討健康兒童和便秘患者腸道微生物組成間的差異，并有益于發(fā)現(xiàn)更多的腸道菌群制劑，或許在未來對腸道菌群的調(diào)節(jié)會成為治療FC兒童的靶點。