林道潑，邵曉曉，胡定元，吳昊，蔣益

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027

腸道巨噬細(xì)胞是參與腸黏膜免疫系統(tǒng)構(gòu)建的重要細(xì)胞之一，在保護(hù)腸黏膜免遭病原體侵害以及調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，M0型巨噬細(xì)胞在不同局部微環(huán)境因素作用下可極化為促炎的經(jīng)典激活型巨噬細(xì)胞（M1型）和抗炎的替代激活型巨噬細(xì)胞（M2型）兩種表型[2]。當(dāng)微環(huán)境發(fā)生改變，將觸發(fā)巨噬細(xì)胞的表型和功能在M1和M2型之間動(dòng)態(tài)變化，稱為巨噬細(xì)胞極化[3]。

克羅恩?。–rohn’s disease, CD）是一類病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，可累及口腔至肛門的各段消化道。多數(shù)研究提示巨噬細(xì)胞數(shù)目和功能異常與CD發(fā)病密切相關(guān)[4]。目前治療CD常用的一線生物制劑如英夫利昔單抗（infliximab,IFX）和烏司奴單抗（ustekinumab, UST）均能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性信號(hào)通路和（或）誘導(dǎo)抗炎型巨噬細(xì)胞極化，影響巨噬細(xì)胞功能[5-6]。研究表明IFX治療后黏膜愈合的炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases, IBD）患者腸組織中，CD68+CD206+M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，提示M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)可能參與黏膜愈合過(guò)程[6]。亦有學(xué)者通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路開(kāi)發(fā)治療IBD的新型藥物，如磷酸二酯酶4（phosphodiesterase-4, PDE4）抑制劑[7]。因此，積極研發(fā)新的靶向巨噬細(xì)胞的藥物，可能有助于IBD疾病控制。

人類T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein 3, Tim-3）最初被發(fā)現(xiàn)于輔助性T細(xì)胞（T helper cell, Th）1上，Tim-3與其配體半乳糖凝集素（galectin, GAL）-9結(jié)合后能誘導(dǎo)已激活的Th1凋亡，直接抑制Th1型免疫反應(yīng)。近期研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3在各種固有免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中都存在表達(dá)且發(fā)揮不同調(diào)控作用[8]。與其公認(rèn)的對(duì)T細(xì)胞免疫的負(fù)調(diào)節(jié)作用相反，Tim-3對(duì)巨噬細(xì)胞的作用是復(fù)雜且有爭(zhēng)議的，取決于不同的疾病微環(huán)境[9]。因此本研究擬基于生物信息學(xué)，探索Tim-3在CD患者腸組織中的表達(dá)及其可能的臨床意義，并進(jìn)一步分析Tim-3表達(dá)與巨噬細(xì)胞的關(guān)系，為詮釋Tim-3影響IBD發(fā)病的潛在機(jī)制提供線索。

1 對(duì)象和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus, GEO）中下載CD的表達(dá)譜芯片。表達(dá)譜芯片下載編號(hào)為GSE112366、GSE75214、GSE16879和GSE186582。GSE112366共包含66例活動(dòng)期CD患者、35例緩解期CD患者和26名健康受試者的人腸組織標(biāo)本，測(cè)序平臺(tái)為GPL13158；GSE75214包含59例活動(dòng)期CD患者、16例緩解期CD患者和22名健康受試者的人腸組織標(biāo)本，測(cè)序平臺(tái)為GPL6244。GSE16879共包含37例活動(dòng)期CD患者和12名健康受試者的人腸組織標(biāo)本，測(cè)序平臺(tái)為GPL570；GSE186582共包含102例活動(dòng)期CD患者和25名健康受試者的人腸組織標(biāo)本，測(cè)序平臺(tái)為GPL570。

1.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化 使用GEO2R在線工具，通過(guò)探針I(yè)D號(hào)查找到Tim-3基因在腸組織中的mRNA表達(dá)量，當(dāng)多個(gè)探針對(duì)應(yīng)Tim-3基因時(shí)取最大值。同時(shí)獲取各芯片中CD患者對(duì)應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)（內(nèi)鏡下評(píng)分和生物制劑應(yīng)答情況），以分析Tim-3的mRNA表達(dá)與生物制劑療效和疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。GSE16879數(shù)據(jù)集共篩選37例CD患者，其中結(jié)腸型CD患者19例，回腸型CD患者18例，均為經(jīng)糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療失敗的活動(dòng)期CD患者。在IFX首次靜脈輸注前1周內(nèi)進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查并取治療前活檢。如果患者只接受IFX（5 mg/kg）單劑靜脈注射治療誘導(dǎo)緩解，于第4周進(jìn)行治療后內(nèi)鏡下組織活檢；如患者采用IFX（5 mg/kg）于第0、2、6周靜脈注射治療誘導(dǎo)緩解，則于第6周接受治療后內(nèi)鏡下活檢。所有活檢均取腸道炎癥部位。根據(jù)D’HAENS等[10]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行CD患者腸組織內(nèi)鏡下組織學(xué)評(píng)分。對(duì)結(jié)腸型CD患者，內(nèi)鏡下組織學(xué)評(píng)分下降至少3分認(rèn)為黏膜改善，11例患者達(dá)到黏膜改善為IFX應(yīng)答組，8例患者未達(dá)到黏膜改善為IFX無(wú)應(yīng)答組。而對(duì)回腸型CD患者，內(nèi)鏡下潰瘍明顯改善或內(nèi)鏡下組織學(xué)評(píng)分出現(xiàn)下降即認(rèn)為IFX應(yīng)答，共8例患者納入IFX應(yīng)答組，10例患者納入IFX無(wú)應(yīng)答組。GSE112366數(shù)據(jù)集共篩選37例中重度活動(dòng)期CD患者，其CD活動(dòng)指數(shù)（Crohn’s disease activity index, CDAI）為220～450分，既往均為激素、免疫抑制劑或IFX治療失敗，統(tǒng)一采用UST于第0周靜脈注射治療誘導(dǎo)緩解，給藥劑量根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算[260 mg（體質(zhì)量≤55 kg），390 mg（55 kg＜體質(zhì)量≤85 kg），520 mg（體質(zhì)量＞85 kg）]，首次注射后隨訪6周，依據(jù)CDAI評(píng)分進(jìn)行療效評(píng)估。CDAI評(píng)分下降大于100分，或者CDAI基線水平為220～248分的CD患者經(jīng)治療后CDAI＜150歸為UST應(yīng)答組，反之為UST無(wú)應(yīng)答組，在第0周及第8周進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查并取腸道炎性部位組織進(jìn)行活檢。

1.3 CD腸組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)分析 采用Cibersort計(jì)算方法估算所有活動(dòng)期CD樣本中的巨噬細(xì)胞比例，計(jì)算次數(shù)設(shè)定在100次，然后進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，只選擇P＜0.05的CD樣本進(jìn)行巨噬細(xì)胞與Tim-3的mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性分析。

1.4 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CD患者和健康對(duì)照者腸組織中Tim-3及CD68表達(dá)和CD68+Tim-3+巨噬細(xì)胞的比例 收集2020年10月至2021年9月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院行結(jié)腸鏡檢查的12例活動(dòng)期初治CD患者的炎性腸組織標(biāo)本，其中男10例，女2例，年齡（26±6）歲。疾病部位：回腸末端型6例，結(jié)腸型0例，回結(jié)腸型6例，上消化道型2例。疾病行為：非狹窄非穿透型5例，狹窄型6例，穿透型1例，合并肛周疾病3例。依據(jù)2016年歐洲克羅恩和結(jié)腸炎組織（European Chron’s and Colitis Organization, ECCO）頒布的CD診治指 南[11]，經(jīng)臨床、消化內(nèi)鏡、實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)及病理組織學(xué)等綜合確立CD診斷。納入前排除糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腸結(jié)核、缺血性腸炎、放射性腸炎和腫瘤等疾病。研究方案取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件號(hào)：2021-K-90-02），觀察對(duì)象均知情同意。同期在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院體檢中心收集15名健康對(duì)照者腸組織作為對(duì)照組，其中男12名，女3名，年齡（25±7）歲。納入前排除糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腸結(jié)核、缺血性腸炎、放射性腸炎和腫瘤等疾病。將收集到腸組織進(jìn)行免疫熒光雙染。按照三色多重?zé)晒馊旧噭┖械牟僮鞑襟E進(jìn)行操作，具體如下：腸組織標(biāo)本常規(guī)行石蠟包埋、切片、脫蠟，使用3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3% BSA封閉。在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的一抗[抗兔CD68，1:1 000，英國(guó)Abcam公司；抗兔Tim-3抗體，1:300，美國(guó)CST公司]，避光濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，每次5 min，加 HRP二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。滴加不同發(fā)射波長(zhǎng)的TYR熒光染料（TYR-488或TYR-CY3熒光染料）反應(yīng)10～15 min。取出37 ℃復(fù)溫45 min后用PBS漂洗3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加DAPI染液室溫避光孵育10 min。PBS再洗3次，切片甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。用Image proplus 6.0計(jì)算每個(gè)樣本CD68+和CD68+Tim-3+細(xì)胞的數(shù)量，取5個(gè)視野平均值，由兩名研究者分別獨(dú)立閱片，最后計(jì)算CD68+Tim-3+細(xì)胞占CD68+細(xì)胞的比例。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)CD患者和健康對(duì)照者腸組織中Tim-3及M1、M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá) 收集2022年7月至2022年10月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院行結(jié)腸鏡檢查的6例活動(dòng)期初治CD患者的炎性腸組織標(biāo)本，其中男4例，女2例，年齡（28±5）歲。疾病部位：回腸末端型4例，回結(jié)腸型2例。疾病行為均為非狹窄非穿透型。同期在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院體檢中心收集8名健康對(duì)照者腸組織作為對(duì)照組，其中男5名，女3名，年齡（29±6）歲。診斷及排除標(biāo)準(zhǔn)同前。將收集到的腸組織置于TRIzol液中裂解，0.2 mL氯仿抽提，離心，70%乙醇洗滌，DEPC水溶解，使用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的含量及濃度。cDNA合成具體步驟按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。引物序列見(jiàn)表1，基因PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以標(biāo)準(zhǔn)管家基因（GAPDH）為參照，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 CD患者腸組織基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 本研究中GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的原始數(shù)據(jù)采用GEO2R在線工具或GraphPad Prism軟件（version 8.0.1）分析。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析連續(xù)變量是否符合正態(tài)分布。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon Signed Rank檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。將IFX治療第0周CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平作為參數(shù)，采用受試者工作特征（ROC）曲線分析這些參數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)IFX療效的臨床價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tim-3的mRNA水平在CD和正常腸組織中的表達(dá)差異 初步利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD患者腸組織和正常組織中Tim-3基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明活動(dòng)期CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。對(duì)GSE112366和GSE75214數(shù)據(jù)集進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與緩解期CD患者相比，活動(dòng)期CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平亦顯著升高（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組芯片GSE112366（A）、GSE75214（B）、GSE16879（C）和GSE186582（D）分析腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平

2.2 Tim-3的mRNA表達(dá)水平與CD患者疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系及與CD患者生物制劑療效的關(guān)系 從GSE112366數(shù)據(jù)集中篩選有記錄CD簡(jiǎn)化內(nèi)鏡（SES-CD）評(píng)分的活動(dòng)期CD患者，利用Spearman秩相關(guān)分析，觀察腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平與SES-CD評(píng)分之間的關(guān)系?；顒?dòng)期CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平與SES-CD評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.39，P＜0.001）。根據(jù)初次IFX治療4～6周有無(wú)內(nèi)鏡下緩解，從GSE16879數(shù)據(jù)集中篩選對(duì)IFX治療有應(yīng)答的活動(dòng)期CD患者19例，發(fā)現(xiàn)IFX治療后CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平較IFX治療前顯著降低（P＜0.01）。根據(jù)初次UST治療6周有無(wú)臨床應(yīng)答，從GSE112366數(shù)據(jù)集中篩選對(duì)UST有應(yīng)答的活動(dòng)期CD患者16例，發(fā)現(xiàn)UST治療后腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平較UST治療前降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.07）。

為嘗試探索腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平在CD患者中是否可以發(fā)揮早期的生物制劑療效預(yù)測(cè)作用，我們比較第0周CD患者IFX或UST治療前，IFX應(yīng)答組與IFX無(wú)應(yīng)答組腸組織中Tim-3基因的表達(dá)差異。與IFX無(wú)應(yīng)答組相比，IFX應(yīng)答組第0周腸組織Tim-3表達(dá)水平較低（P＜0.05）；而CD腸組織Tim-3表達(dá)水平在UST應(yīng)答組和UST無(wú)應(yīng)答組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。為進(jìn)一步評(píng)估CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平對(duì)預(yù)測(cè)IFX臨床療效的價(jià)值，本研究采用ROC曲線分析CD患者治療第0周檢測(cè)的腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平對(duì)預(yù)測(cè)第4～6周IFX療效的價(jià)值（AUC=0.70，P=0.04）。見(jiàn)圖2。

圖2 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組芯片GSE112366、GSE16879分析CD患者腸組織中Tim-3基因表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度和生物制劑療效的關(guān)系

2.3 Cibersort方法估算活動(dòng)期CD樣本中的巨噬細(xì)胞比例及其與腸組織中Tim-3 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 基于Cibersort算法分析CD腸組織中浸潤(rùn)的M0、M1和M2巨噬細(xì)胞比例。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在GSE186582、GSE75214和GSE112366數(shù)據(jù)集中，活動(dòng)期CD患者腸組織Tim-3的表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞M0比例呈正相關(guān)（r=0.45，P＜0.05；r=0.48，P＜0.05；r=0.34，P＜0.05），見(jiàn)圖3。在GSE186582、GSE16879和GSE75214數(shù)據(jù)集中，活動(dòng)期CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞M1比例呈正相關(guān)（r=0.54，P＜0.001；r=0.53，P＜0.01；r= 0.61，P＜0.001），見(jiàn)圖4。而僅在GSE186582數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞M2比例呈負(fù)相關(guān)（r=-0.43，P＜0.001），見(jiàn)圖5。

圖3 腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平與M0型巨噬細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

圖4 腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平與M1型巨噬細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

圖5 腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平與M2型巨噬細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

2.4 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CD患者和健康對(duì)照者腸組織中Tim-3及CD68表達(dá)和CD68+Tim-3+巨噬細(xì)胞的比例 免疫熒光染色結(jié)果顯示，CD患者炎性腸黏膜中CD68和Tim-3表達(dá)均高于健康對(duì)照者正常腸黏膜。此外，CD68+Tim-3+雙陽(yáng)性巨噬細(xì)胞占CD68+巨噬細(xì)胞比例在CD患者炎性部位亦顯著增多（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CD患者和健康對(duì)照者腸組織中Tim-3、CD68的表達(dá)和CD68+ Tim-3+巨噬細(xì)胞占CD68+巨噬細(xì)胞的比例

2.5 熒光定量PCR法檢測(cè)CD患者和健康對(duì)照者腸組織中Tim-3及M1、M2巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá) 活動(dòng)期CD患者腸組織中Tim-3 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，活動(dòng)期CD患者腸組織Tim-3 mRNA表達(dá)水平與M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.93，P＜0.01；r=0.85，P＜0.05），而與M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性（r=-0.04，P＞0.05；r=0.22，P＞0.05）。

3 討論

圖7 熒光定量PCR檢測(cè)活動(dòng)期CD腸組織中Tim-3和M1、M2相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平觀察活動(dòng)期CD患者中Tim-3表達(dá)水平與M1、M2相關(guān)細(xì)胞因子水平之間的關(guān)系

KIM等[12]研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期兒童CD患者腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平較健康對(duì)照者升高，而這些患者經(jīng)IFX治療后腸組織中Tim-3的mRNA表達(dá)水平顯著降低，此外，在IFX治療期間，CD患者結(jié)腸黏膜中的Tim-3的mRNA表達(dá)水平與兒童CDAI呈正相關(guān)。與之一致，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，活動(dòng)期CD患者腸組織中Tim-3表達(dá)升高，且與內(nèi)鏡下SES-CD評(píng)分呈正相關(guān)。此外，對(duì)同一CD患者IFX或UST治療前后的情況進(jìn)行自身比較發(fā)現(xiàn)，生物制劑治療后腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平亦顯著下降?；谏镄畔W(xué)的研究基礎(chǔ)，本研究進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在本中心的臨床標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示活動(dòng)期CD患者炎癥腸組織中Tim-3表達(dá)較健康對(duì)照者正常腸黏膜顯著升高。上述結(jié)果提示活動(dòng)期CD患者腸組織Tim-3表達(dá)變化與疾病活動(dòng)密切相關(guān)。

迄今為止，多項(xiàng)研究表明Tim-3表達(dá)水平是反映自身免疫性疾病活動(dòng)度的重要參數(shù)。ASANO等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者相比，SLE患者血清中可溶性Tim-3（soluable Tim-3, sTim-3）水平升高，且與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)SLEDAI-2K評(píng)分顯著正相關(guān)，進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，合并腎臟受累的SLE患者血清sTim-3水平較無(wú)腎臟病SLE患者顯著升高，提示血清sTim-3可以作為SLE疾病活動(dòng)度的預(yù)測(cè)指標(biāo)。而對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和關(guān)節(jié)液中Tim-3+細(xì)胞比例較健康對(duì)照者升高，進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)CD4+、CD8+、自然殺傷T細(xì)胞和單核細(xì)胞上的Tim-3表達(dá)均增高，但外周血Tim-3+細(xì)胞比例與疾病活動(dòng)指數(shù)和血清TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)[14]。

研究表明，CD患者腸道手術(shù)史、疾病部位、是否合用免疫抑制劑、CRP等可能是影響IFX療效的重要因素[15]。但目前仍缺乏統(tǒng)一認(rèn)可的，可特異性用于評(píng)估和預(yù)測(cè)IFX臨床療效的指標(biāo)。本研究創(chuàng)新性采用ROC曲線評(píng)估CD患者腸道Tim-3的mRNA表達(dá)水平對(duì)預(yù)測(cè)IFX療效的臨床價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在活動(dòng)期CD患者接受IFX治療前，檢測(cè)腸組織Tim-3表達(dá)水平對(duì)IFX治療第0～6周的臨床療效可能具有預(yù)測(cè)價(jià)值，有望成為評(píng)估IFX療效的新指標(biāo)。

目前普遍認(rèn)為M1/M2型巨噬細(xì)胞極化是維持體內(nèi)免疫炎癥穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，但Tim-3在巨噬細(xì)胞中的作用仍有爭(zhēng)議，在不同疾病中，巨噬細(xì)胞上的Tim-3可以調(diào)節(jié)M1和M2巨噬細(xì)胞之間的比例，作為促炎或抗炎調(diào)節(jié)因子[16-17]。YU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠比較，腦出血小鼠腦血腫組織中M1型巨噬細(xì)胞比例增多，從而引起腦組織損傷。JIANG 等[17]對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠研究發(fā)現(xiàn)，注射抗Tim-3抗體會(huì)導(dǎo)致小鼠結(jié)腸組織中M1型巨噬細(xì)胞增加，小鼠病情加重，而Tim-3的轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)則可誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞減少，緩解病情。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Tim-3可能通過(guò)下游轉(zhuǎn)錄因子TRIF和IRF3促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化。本研究基于Cibersort算法分析CD腸組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期CD患者腸組織Tim-3的mRNA表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞M0和M1比例呈正相關(guān)，免疫熒光結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期CD患者炎性腸組織中CD68+Tim-3+巨噬細(xì)胞較正常腸黏膜顯著增多，熒光定量PCR結(jié)果提示Tim-3的mRNA表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞M1相關(guān)細(xì)胞因子水平呈正相關(guān)，這提示Tim-3表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致局部腸組織促炎型巨噬細(xì)胞應(yīng)答上調(diào)，從而在CD疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。導(dǎo)致本研究結(jié)果與基于小鼠的研究相矛盾原因可能如下：體外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂多糖可能通過(guò)Tim-3/galectin-9影響M1/M2巨噬細(xì)胞極化，且在不同時(shí)間點(diǎn)M1/M2比例存在動(dòng)態(tài)變化[18]，因此我們推測(cè)在疾病的不同階段，Tim-3可能發(fā)揮不同作用。而既往的動(dòng)物研究?jī)H通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)方式模擬急性腸炎的過(guò)程，未模擬慢性活動(dòng)性腸炎，這可能是本研究結(jié)果與既往基于小鼠的研究相矛盾的原因之一，此外，化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型僅能模擬IBD的某一方面，本研究擬后續(xù)采用基因工程模型或轉(zhuǎn)基因IBD動(dòng)物模型進(jìn)一步探討Tim-3在IBD中的作用。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)和免疫熒光方法探討Tim-3表達(dá)水平與CD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，結(jié)果表明Tim-3可能通過(guò)影響M1型巨噬細(xì)胞極化在CD發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，且可能預(yù)測(cè)早期IFX療效（高水平Tim-3表達(dá)提示預(yù)后較差）。這些結(jié)果為Tim-3在臨床治療中的應(yīng)用和CD的分子靶向治療提供了新的理論支持，但本研究患者樣本量較少，仍需后續(xù)加大樣本量，及更深入的機(jī)制研究加以證實(shí)。