◎ 彭名軍，劉春生，毛新武，周慶瓊，戚 平，林子豪，曾豪威

（廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 511400）

角黃素與葉黃素是類胡蘿卜素中應(yīng)用較為廣泛的著色劑，具有類胡蘿卜素特有抗氧化作用[1-2]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等方面[3]。養(yǎng)殖人員可能在飼料中添加角黃素與葉黃素，特別是在產(chǎn)蛋禽類和有色水產(chǎn)品（如黃骨魚、觀賞魚）的養(yǎng)殖過程中添加，可改善禽類皮膚或禽蛋蛋黃的顏色和有色水產(chǎn)魚類皮膚的顏色，提高其商品價(jià)值。角黃素易蓄積在人體視網(wǎng)膜上，長期攝入會引起視網(wǎng)膜的損傷[4]。1995年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）制定了角黃素可接受的每日最大攝入量為0.03 mg·kg-1（按體重計(jì)）[5]。2006年，日本“肯定列表制度”規(guī)定禽蛋等動物源性食品中角黃素最大殘留量為0.1 mg·kg-1[6]。目前我國尚未對動物性食品中角黃素和葉黃素的殘留制定限量標(biāo)準(zhǔn)，但《飼料添加劑品種目錄（2013）》規(guī)定，角黃素只允許在家禽養(yǎng)殖過程中使用，不允許在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用。天然葉黃素允許在家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用。角黃素或葉黃素的檢測方法主要有高效液相色譜法[7-13]、高效液相色譜質(zhì)譜法[6]，同時(shí)測定角黃素與葉黃素的檢測方法較少。本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，對有色魚類皮膚組織中角黃素與葉黃素的檢測方法進(jìn)行研究，建立一種同時(shí)測定水產(chǎn)魚類中角黃素與葉黃素的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

角黃素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：514-78-3），純度≥99.8%（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：514-78-3），純度＞90%（上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；乙酸（LC/MS級，美國Thermo Fisher Scientific公司）；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT），純度≥99.0%（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

Q Exactive? LCMS-U3000高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Allegra X-30R離心機(jī)（美國貝克曼公司）；旋渦振蕩混合器（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

角黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取2.5 mg角黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至25 mL，-20 ℃保存。

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取2.5 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至25 mL，-20 ℃保存。

0.1%BHT-乙腈溶液：準(zhǔn)確稱取0.1 g BHT標(biāo)準(zhǔn)品，用100 mL乙腈溶解，混勻。

角黃素、葉黃素混合中間液（10 μg·mL-1）：分別準(zhǔn)確吸取角黃素、葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL，用0.1%BHT-乙腈溶液定容至10 mL，混勻。

角黃素、葉黃素混合工作液：準(zhǔn)確吸取一定體積的角黃素、葉黃素混合中間液，用0.1%BHT-乙腈溶液配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品處理

試樣制備：取一定量魚皮組織，切碎后混合均勻，置于-20 ℃冰箱中儲存。

樣品提?。簻?zhǔn)確稱取2.50 g樣品，加入10 mL提取溶劑0.1%BHT-乙腈，渦旋振蕩5 min，8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，用提取溶劑定容。取0.5 mL提取液至10 mL比色管，用提取溶劑定容，搖勻后過0.22 μm濾膜，上機(jī)待測。由于角黃素、葉黃素對光與溫度敏感，實(shí)驗(yàn)保持在避光且溫度不超過35 ℃的環(huán)境下進(jìn)行。

1.2.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

（1）液相條件。色譜柱：Thermo Fisher Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A為0.1%乙酸水（含10%甲醇），流動相B為0.1%乙酸-甲醇；A∶B=1∶19等度洗脫；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.3 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。采用電噴霧電離源（ESI）正離子電離模式，噴霧電壓3.5 kV，鞘氣流速45 L·min-1，輔助氣流速15 L·min-1，離子傳輸管溫度320 ℃，噴霧器溫度350 ℃，采用PRM模式，分辨率為17500。角黃素和葉黃素質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 角黃素、葉黃素質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

角黃素與葉黃素不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)分別選取甲醇、乙腈為有機(jī)相，0.1%乙酸水、5 mmol乙酸銨為水相，進(jìn)行兩兩組合試驗(yàn)，具體組合見表2。角黃素與葉黃素在4組流動相體系下的色譜圖見圖1和圖2。

圖1 角黃素在4組流動相體系下的色譜圖

圖2 葉黃素在4組流動相體系下的色譜圖

表2 4種流動相組合試驗(yàn)表

對于角黃素，上述4種流動相的不同組合對其峰形的影響無顯著差異。對于葉黃素，使用乙腈作為有機(jī)相，相對于使用甲醇時(shí)，峰形明顯變寬，甚至出現(xiàn)3頭峰的情況。使用0.1%乙酸水或5 mmol乙酸銨作為水相，對葉黃素峰形的影響無顯著差異，因此選擇容易配制且對色譜柱更友好的0.1%乙酸水。同時(shí)，為抑制水相中微生物的生長，在0.1%乙酸水中添加10%甲醇。為穩(wěn)定流動相整體的pH值，在有機(jī)相中加入與水相相同體積的0.1%乙酸。

2.2 流動相的比例研究

本實(shí)驗(yàn)分別研究梯度洗脫與等度洗脫對角黃素與葉黃素峰形的影響。采用等度（水相比例分別嘗試5%和10%）與梯度（水相比例為0～3 min，100% ～ 10%；3～ 10 min，10%；10～ 13 min，10%～100%）兩種方式分別進(jìn)行洗脫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用高比例有機(jī)相等度洗脫，化合物的峰形與梯度洗脫無差異，無其他雜質(zhì)干擾，而等度洗脫化合物出峰時(shí)間早，分析時(shí)間更短，故本實(shí)驗(yàn)流動相的比例為0.1%乙酸水（含10%甲醇）∶0.1%乙酸甲醇=5%∶95%。

2.3 進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量的大小影響化合物的最低檢測濃度，同時(shí)影響化合物的峰形（見圖3、圖4）。

圖3 角黃素在不同進(jìn)樣體積下的色譜圖

本實(shí)驗(yàn)對濃度為100 μg·L-1的角黃素與葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣 1 μL、2 μL、5 μL、8 μL 和 10 μL，比較研究化合物色譜峰的峰形。結(jié)果表明，角黃素與葉黃素的色譜峰均隨著進(jìn)樣體積的增大而變寬，特別是葉黃素進(jìn)樣體積為8 μL時(shí)，其峰寬是進(jìn)樣體積為5 μL時(shí)的2倍，如圖4。因此，綜合考慮化合物色譜峰峰形，選擇較高進(jìn)樣體積以降低儀器對化合物的最低檢測濃度的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇進(jìn)樣量為5 μL。

圖4 葉黃素在不同進(jìn)樣體積下的色譜圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)研究

選取羅非魚、紅魚、金鯧魚等3種水產(chǎn)魚類的提取液作為空白基質(zhì)，分別用純乙腈溶劑、空白基質(zhì)原液、空白基質(zhì)原液的10倍、20倍、50倍、100倍稀釋液，配制 10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1的角黃素與葉黃素系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過分別比較不同水產(chǎn)魚類基質(zhì)、同一水產(chǎn)魚類不同稀釋倍數(shù)基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值，分別研究不同水產(chǎn)魚類基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)差異和同一水產(chǎn)魚類不同稀釋倍數(shù)基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)變化規(guī)律，確定能夠消除基質(zhì)效應(yīng)的最優(yōu)稀釋倍數(shù)。

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect）計(jì)算公式為

式中：X為基質(zhì)效應(yīng)；bs為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；bm為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖6所示，角黃素與葉黃素在3種水產(chǎn)魚類提取液基質(zhì)原液中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，2種化合物離子響應(yīng)抑制率在-98%～-37%。隨著基質(zhì)原液稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯減弱，在20倍稀釋倍數(shù)時(shí)減弱趨勢變小，漸趨平穩(wěn)，基質(zhì)效應(yīng)基本保持在-25%～+20%。因此，為減少基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)樣品提取液稀釋倍數(shù)為稀釋20倍。

圖5 角黃素在3種水產(chǎn)魚中的基質(zhì)效應(yīng)圖

圖6 葉黃素在3種水產(chǎn)魚中的基質(zhì)效應(yīng)圖

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍、曲線方程、檢出限及定量限

用 100 mg·L-1標(biāo) 準(zhǔn) 儲 備 液 配 制 10 mg·L-1的 角黃素與葉黃素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.010 mL、0.020 mL、0.050 mL、0.080 mL和0.100 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈定容至10 mL，配成濃度為10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、80 μg·L-1和 100 μg·L-1標(biāo) 準(zhǔn) 系列，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用不同基質(zhì)空白溶液配制濃度為10 μg·L-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定該濃度下信噪比（S/N），通過換算，計(jì)算S/N=3和S/N=10時(shí)對應(yīng)的濃度，即為方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在濃度0～100 μg·L-1，角黃素與葉黃素的校正曲線相關(guān)系數(shù)r均≥0.996，線性良好。角黃素在3種水產(chǎn)魚基質(zhì)的方法檢出限在0.03～0.09 mg·kg-1，定量限在0.09～0.30 mg·kg-1。葉黃素在3種水產(chǎn)魚基質(zhì)的方法檢出限在0.07～0.10 mg·kg-1，定量限在0.22～0.51 mg·kg-1。線性范圍、曲線方程、檢出限及定量限詳見表3。

表3 角黃素和葉黃素線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限表

2.5.2 方法的準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

采用加標(biāo)回收試驗(yàn)，在空白羅非魚、紅魚、黃骨魚樣品中，加入角黃素與葉黃素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至2 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的 3 個(gè)水平，每個(gè)水平樣品重復(fù)處理測定6次，計(jì)算回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察方法準(zhǔn)確度與日內(nèi)精密度。連續(xù)3天進(jìn)行重復(fù)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察方法日間精密度。由表4可知，方法的平均回收率為85.5%～117.7%，日內(nèi)精密度為0.8%～6.2%，日間精密度為2.1%～11.3%。方法的準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)結(jié)果均符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[15]對回收率與精密度的要求，方法具有穩(wěn)定可靠性。

表4 3種水產(chǎn)魚加標(biāo)回收率和日內(nèi)、日間精密度表（n=6）

2.6 實(shí)際樣品測定

采用本實(shí)驗(yàn)對線下實(shí)體商超和線上購物平臺采購的黃骨魚、金昌魚、大小黃魚等21個(gè)水產(chǎn)魚類樣品中的角黃素與葉黃素進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，21個(gè)水產(chǎn)魚樣品中均未檢出角黃素。4個(gè)黃骨魚樣品中檢出葉黃素，含量在2.09～2.44 mg·kg-1。從檢測情況看，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中違規(guī)使用角黃素的風(fēng)險(xiǎn)較低。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)魚類中角黃素與葉黃素的含量。Thermo Fisher Accucore aQ色譜柱能夠?qū)屈S素與葉黃素進(jìn)行分離，以0.1%BHT-乙腈溶液為提取液，采用0.1%乙酸水溶液和0.1%乙酸甲醇溶液作為流動相，以1∶19的比例等度洗脫，在質(zhì)譜（ESI+）正離子模式下以平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）模式檢測。在0～100 μg·L-1，角黃素、葉黃素的濃度與色譜峰面積分別呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.996與0.997。方法的準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)結(jié)果均符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）對回收率與精密度的要求，為水產(chǎn)魚類中角黃素與葉黃素的檢測提供了準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠的檢測方法。