◎ 安 妮，何天豪，余 潔，姜皓琤，嚴(yán)禧堃，冉玲玲，葛 建，侯 歡

（1.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江山嶼海康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 杭州 310011）

近年來(lái)，肥胖的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)快速上升，與糖尿病、心腦血管疾病的發(fā)生都有密切的聯(lián)系，而脂肪類膳食攝入過(guò)多是引起肥胖、“三高”等慢性病的主要因素[1]。因此，開(kāi)展天然功能因子的穩(wěn)定性保護(hù)、靶向遞送以及復(fù)配探索研究，已成為近年來(lái)藥品食品科學(xué)的探索熱點(diǎn)與趨勢(shì)。

原花青素是植物中提取的具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防和治療心血管疾病等作用的多酚類物質(zhì)[2-3]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在大量酚羥基，能夠提供電子，從而中斷自由基反應(yīng)[4]。天然原花青素廣泛存在于葡萄、茶葉、可可、大麥等植物中。楊梅葉中也富含原花青素[5]。殼聚糖含有氨基、羥基等具有生物活性的功能基團(tuán)，也具有抗氧化和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等功效[6]。殼聚糖在腸道內(nèi)能與膽酸鹽如甘氨膽酸鈉（Sodium Glycyl Acid，GA）或?；悄懰徕c（Sodium Taurocholate Acid，TA）結(jié)合，干擾膽酸鹽的腸肝循環(huán)，促進(jìn)膽酸鹽排泄，阻止膽汁酸重吸收，促使血漿及肝臟中的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而起到降血脂的效果。殼聚糖還可以通過(guò)吸附膽汁酸，抑制脂肪消化，從而減少機(jī)體吸收脂類物質(zhì)，達(dá)到降低血脂的作用[7]。

微凝膠是尺寸在0.1～1 000.0 μm，通過(guò)聚合物分子（如多糖、蛋白等）間的交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的顆粒[8-9]。它表現(xiàn)出無(wú)毒、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有生物相容性和可降解性等一系列特殊的性質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用空間并具有一定的安全性[10]。殼聚糖等聚合物雖有良好的生物相容性，但無(wú)法被人體內(nèi)消化酶所降解，因此適合用于原花青素等功能因子的定向（結(jié)腸）釋放[11]。將殼聚糖與楊梅葉原花青素制成微凝膠后，其生物活性物質(zhì)在各種環(huán)境中的穩(wěn)定性能夠顯著提高[12]。

本研究采用磁力攪拌制備殼聚糖/原花青素微凝膠，并探究其協(xié)同抗氧化作用，通過(guò)在體外模擬人體消化環(huán)境的實(shí)驗(yàn)，研究不同因素對(duì)微凝膠與膽酸鹽結(jié)合能力的影響，旨在探討其與膽酸鹽結(jié)合的適宜條件，以期為殼聚糖/原花青素微凝膠在藥品食品中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同聚合度楊梅葉原花青素，實(shí)驗(yàn)室自制；殼聚糖、過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵七水合物，購(gòu)于上海泰坦科技股份有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH，生物試劑），購(gòu)于梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）；二銨鹽（ABTS，生物試劑），購(gòu)于上海麥克林生化有限公司；甘氨膽酸鈉鹽和?；悄懰徕c鹽（純度：95%），購(gòu)于上海阿拉丁有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；高效液相色譜儀（日本島津Shimadzu 20AT）；85-1磁力攪拌器；SC-30A數(shù)控超級(jí)恒溫槽；XW-80A旋渦混合器；KQ-250B型超聲波清洗器；EL204電子天平；高速離心機(jī)（MIKRO 22R，德國(guó) Hettich）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微凝膠的制備

將殼聚糖溶于1%醋酸溶液，磁力攪拌至無(wú)沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆?。將楊梅葉原花青素溶于1%乙醇溶液，磁力攪拌 2 h，5 000 r·min-1離心 15 min，用 0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?。取殼聚糖溶液與楊梅葉原花青素溶液按照3∶1（體積比）比例混合置于圓底燒瓶中封口后磁力攪拌2 h，即得殼聚糖/楊梅葉原花青素微凝膠（以下簡(jiǎn)稱微凝膠）。

1.3.2 抗氧化能力評(píng)價(jià)

（1）DPPH自由基清除能力測(cè)定。參考柳埃塔爾[13]的方法并稍作調(diào)整。分別取200 μL楊梅葉原花青素、殼聚糖以及微凝膠與4.5 mL的100 μmol·L-1DPPH乙醇溶液混合，旋渦振蕩30 s后置于暗處30 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度A1。用水替代樣品溶液作空白組A空白1，乙醇代替DPPH乙醇溶液作對(duì)照組A對(duì)照1。DPPH清除率計(jì)算公式為清除率=［1-(A1-A對(duì)照1)/A空白1］×100%。

（2）ABTS自由基清除能力測(cè)定。參照凱塔爾[14]的方法并稍作調(diào)整，精確稱取0.384 1 gABTS，加乙醇溶解并定容至100 mL。加入0.066 2 g過(guò)硫酸鉀，室溫避光條件下靜置過(guò)夜12～16 h。臨用前稀釋ABTS儲(chǔ)存液至734 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.8±0.02，分別取80 μL楊梅葉原花青素、殼聚糖以及微凝膠與3 mL的ABTS反應(yīng)液混合，混勻后室溫避光反應(yīng)6 min。然后在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度A2，用水替代樣品溶液作空白組A空白2，乙醇代替ABTS乙醇溶液作對(duì)照組A對(duì)照2。ABTS清除率計(jì)算公式為清除率=［1-(A2-A對(duì)照2)/A空白2］×100%。

（3）羥基自由基清除能力測(cè)定。參照陳根洪等[15]的方法并稍作調(diào)整。稱取0.025 0 g的七水硫酸亞鐵，加水溶解并定容至10 mL。稱取0.012 4 g水楊酸，加乙醇溶解并定容至10 mL。量取0.099 2 mL的30%H2O2，加水定容至100 mL。將0.2 mL的FeSO4溶液、0.2 mL的水楊酸乙醇溶液、0.3 mL的去離子水分別與0.6 mL的楊梅葉原花青素、殼聚糖、微凝膠混合，搖勻后加入0.2 mL的H2O2溶液，于37 ℃水浴加熱反應(yīng)15 min，然后在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度A3。用水替代樣品溶液作空白組A空白3，乙醇代替水楊酸乙醇溶液作對(duì)照組A對(duì)照3。羥基自由基清除率計(jì)算公式為清除率=［1-(A3-A對(duì)照3)/A空白3］×100%。

1.3.3 膽酸鹽檢測(cè)方法的建立

（1）色譜條件。參照王鳳雙等[16]的方法并稍作調(diào)整。以反相高效液相色譜法測(cè)定甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的含量；色譜柱：Hypersil ODS（150 mm×4.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.6%磷酸二氫鉀（65∶35，V/V）；流速：0.5 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

（2）線性關(guān)系考察。分別制備濃度為200 μmol·L-1、150 μmol·L-1、100 μmol·L-1、50 μmol·L-1、25 μmol·L-1的相同濃度GA和TA的混合溶液，離心后取上清液進(jìn)樣測(cè)定GA和TA各自的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程，考察線性關(guān)系。

（3）精密度實(shí)驗(yàn)。按上述方法制備含有GA和TA 0.05 mmol·L-1、0.10 mmol·L-1、0.20 mmol·L-1的質(zhì)控樣品，同一日期連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄各峰面積，計(jì)算RSD，考察日內(nèi)精密度；于3個(gè)不同日期內(nèi)各連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，根據(jù)每日峰面積平均值計(jì)算RSD，考察日間精密度。

1.3.4 微凝膠結(jié)合膽酸鹽功效探究

（1）人體胃腸道環(huán)境模擬。胃環(huán)境模擬：取一定量樣品，加入1 mL 0.01 mol·L-1的鹽酸溶液，在37 ℃恒溫振蕩1 h。腸環(huán)境模擬：以0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)胃環(huán)境模擬后樣品液pH值為6.3，隨后加入4 mL10 mg·mL-1胰酶，（胰酶以pH6.3的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液配制），在37 ℃恒溫振蕩1 h。

（2）微凝膠功能成分結(jié)合膽酸鹽能力探究。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定膽酸鹽濃度為0.3 mmol·L-1，楊梅葉原花青素濃度為1 mg·mL-1，按“1.3.1”項(xiàng)下配比制作凝膠。分別取微凝膠、殼聚糖/原花青素直接混合物1 mL，經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理后加入4 mL膽酸鹽溶液（TA、GA 濃度均為 0.3 mmol·L-1，用 pH6.3、0.1 mol·L-1磷酸緩沖液配制），恒溫振蕩1 h，4 000 r·min-1離心20 min。對(duì)上清液中膽酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 影響微凝膠與膽酸鹽結(jié)合因素研究

（1）離子強(qiáng)度對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽的影響。取1 mL微凝膠，經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理后吸取6 mL，每個(gè)樣品中加入4 mL膽酸鹽（GA、TA的濃度設(shè)定為0.3 mmol·L-1、0.6 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1，分別以pH6.3，濃度為 0.1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.9 mmol·L-1的不同離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液配制），振蕩，離心。對(duì)上清液中膽酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定。

（2）尿素對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽的影響。將經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理的微凝膠平均分成兩份，其中一份加入一定量尿素（1.5 mmol·L-1）。取6 mL上述試液，每個(gè)樣品中加入4 mL膽酸鹽溶液（GA、TA濃度設(shè)定為0.1 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.7 mmol·L-1、0.9 mmol·L-1， 分 別 以 pH6.3 的 0.1 mol·L-1磷 酸 緩 沖液配制），恒溫振蕩，離心。對(duì)照為取6 mL未加入尿素試液，其余操作相同。對(duì)上清液中膽酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化能力

DPPH清除率檢測(cè)法廣泛應(yīng)用于天然植物提取物的體外抗氧化能力檢測(cè)及抗氧化片段篩選[17]。其乙醇溶液呈紫色，當(dāng)遇到供氫體時(shí)，DPPH自由基被還原為DPPH-H，紫色會(huì)褪去[18]。由表1可知，微凝膠能有效地清除DPPH自由基，殼聚糖和楊梅葉原花青素的抗氧化能力在DPPH體系中有協(xié)同增效作用。

表1 DPPH自由基清除能力表

ABTS清除率檢測(cè)法在抗氧化能力的測(cè)定中應(yīng)用較為廣泛。經(jīng)氧化后的ABTS能夠生成穩(wěn)定的陽(yáng)離子自由基ABTS+·，此時(shí)溶液呈藍(lán)綠色，反應(yīng)體系加入抗氧化劑后褪色[19]。由表2可知微凝膠抗氧化活性略大于楊梅葉原花青素，殼聚糖對(duì)ABTS自由基清除活性小，而二者所制得微凝膠能在一定程度上提高原花青素抗氧化活性。

表2 ABTS自由基清除能力表

羥基自由基會(huì)被原花青素中含有的抗氧化成分消除?！H的強(qiáng)氧化性能夠在水溶液中改變底物的顏色，應(yīng)用紫外分光光度法測(cè)定底物吸光度的改變，間接測(cè)定·OH的濃度[20]。據(jù)此建立本實(shí)驗(yàn)測(cè)定原花青素對(duì)羥基自由基清除的方法。由表3可知，相較于殼聚糖和原花青素的單獨(dú)使用，二者在制成微凝膠后具有良好的抗氧化協(xié)同作用，能夠在一定程度上提高羥基自由基清除能力。

表3 羥基自由基清除能力表

2.2 膽酸鹽檢測(cè)方法學(xué)考察結(jié)果

根據(jù)方法中HPLC檢測(cè)方法，以GA、TA濃度（μmol·L-1）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程為GA：y=2 353x-14 053（R2=0.996 9），TA：y=1 277.3x-9 456.7（R2=0.997 6）。TA的日內(nèi)RSD分別為2.63%、4.61%、2.74%（n=3），日間RSD分別為6.23%、4.38%、5.92%（n=3）；GA的日內(nèi)RSD分別為2.90%、3.36%、3.37%（n=3），日間RSD分別為5.54%、7.05%、2.47%（n=3）。

圖1 甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 微凝膠與殼聚糖/原花青素直接混合物結(jié)合膽酸鹽的能力對(duì)比

由圖2可知，微凝膠的最佳反應(yīng)時(shí)間位于60 min處，而殼聚糖/原花青素直接混合物的最佳反應(yīng)時(shí)間在90 min處。且60 min時(shí)微凝膠的膽酸鹽結(jié)合量（TA 0.375 μmol·mL-1、GA 0.258 μmol·mL-1）明顯高于90 min 殼聚糖 /原花青素直接混合物（TA 0.371 μmol·mL-1、GA 0.237 μmol·mL-1）。說(shuō)明殼聚糖 /楊梅葉原花青素微凝膠體系中存在某種結(jié)構(gòu)，使膽酸鹽的結(jié)合具有協(xié)同增效能力。

圖2 微凝膠、殼聚糖/原花青素直接混合物與膽酸鹽結(jié)合時(shí)間的相關(guān)性分析圖

2.4 離子強(qiáng)度對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽的影響

如圖3所示，在不同離子強(qiáng)度的緩沖溶液中微凝膠對(duì)2種膽酸鹽的結(jié)合量不存在顯著性差異（P＞0.05），表明了離子強(qiáng)度對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽有一定影響，但影響不顯著。

圖3 不同膽酸鹽離子強(qiáng)度對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽的影響圖

2.5 尿素對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽的影響

在有尿素存在的情況下進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，以考察氫鍵作用和吸附過(guò)程的關(guān)系。尿素能夠優(yōu)先在自身與水之間形成氫鍵，暴露膽酸鹽的活性基團(tuán)，進(jìn)而影響膽酸鹽微團(tuán)的穩(wěn)定性。在尿素存在的情況下，殼聚糖/原花青素微凝膠對(duì)2種膽酸鹽的結(jié)合作用結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明尿素對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽有影響但不顯著（P＞0.05）。

圖4 尿素對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽的影響圖

3 結(jié)論

殼聚糖與楊梅葉原花青素都是天然的抗氧化劑，在功能性食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。經(jīng)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)分析可知，殼聚糖/楊梅葉原花青素微凝膠在ABTS與羥基自由基體系中清除自由基的能力大大增強(qiáng)，抗氧化效果明顯高于楊梅葉原花青素與殼聚糖單獨(dú)作用的效果，兩者具有協(xié)同增效作用。通過(guò)微凝膠與直接混合物的膽酸鹽吸附對(duì)比實(shí)驗(yàn)，微凝膠結(jié)合膽酸鈉的能力高于殼聚糖和楊梅葉原花青素的共同作用，初步證實(shí)了微凝膠結(jié)構(gòu)能夠提升其功能性成分對(duì)人體的降血脂功能。另外，離子強(qiáng)度變化和有無(wú)尿素條件對(duì)殼聚糖/楊梅葉原花青素微凝膠結(jié)合膽酸鹽能力均有影響，表明疏水作用力和氫鍵對(duì)微凝膠結(jié)合膽酸鹽有一定貢獻(xiàn)。本研究為天然功能因子的開(kāi)發(fā)利用帶來(lái)了新視角和新途徑，為殼聚糖/楊梅葉原花青素微凝膠在功能性食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域的應(yīng)用創(chuàng)新提供了新的思路。