金博文 李東娜 莊朋偉 郭虹 張艷軍
1天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津 301617);2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(天津 300193)
腦卒中后中樞性疼痛(central post-stroke pain,CPSP)是繼發(fā)于腦卒中之后的慢性中樞性神經(jīng)病理性疼痛,其臨床癥狀主要為卒中后自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏和感覺(jué)異常[1],是導(dǎo)致患者腦卒中后焦慮抑郁的主要原因之一,嚴(yán)重影響了患者卒中后恢復(fù)期的生存質(zhì)量[2]。隨著腦卒中發(fā)病率和存活率的逐年上升[3],CPSP患者數(shù)量逐漸增加,目前關(guān)于CPSP發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在神經(jīng)炎癥、中樞敏化和去抑制三個(gè)方面[4],盡管近年來(lái)取得了一定進(jìn)展,但CPSP的發(fā)病機(jī)制仍不完全明確,對(duì)臨床有效藥物的研發(fā)帶來(lái)了一定困難。
腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic bactor,BDNF)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在的一種基礎(chǔ)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白[5]。BDNF與其受體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)結(jié)合后,自身產(chǎn)生磷酸化,經(jīng)過(guò)磷酸化的TrkB可激活下游多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑而發(fā)揮生物學(xué)功能[6],研究表明,慢性疼痛過(guò)程中BDNF-TrkB通路的異常激活與痛覺(jué)過(guò)敏有著密切聯(lián)系[7],是疼痛傳導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,但關(guān)于BDNF在腦卒后中樞性疼痛的發(fā)病過(guò)程中起到的作用,目前尚無(wú)研究。本研究擬基于丘腦BDNF信號(hào)揭示腦卒中后中樞性疼痛的發(fā)病機(jī)制,為腦卒中后中樞性疼痛的防治提供一定線索。
1.1 材料
1.1.1 儀器 大鼠MCAO線栓(2838A5),北京西濃科技有限公司;小動(dòng)物麻醉機(jī),美國(guó)Matrx公司;石蠟包埋機(jī),轉(zhuǎn)輪切片機(jī),德國(guó)Leica公司;倒置熒光顯微鏡,日本Olympus公司;電泳槽,美國(guó)伯樂(lè)公司;凝膠成像儀,和信偉業(yè)科技有限公司。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡雄性wistar大鼠60只,體質(zhì)量270~300 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2019-0008。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心。
1.1.3 試劑 Neun抗體(ab177487),驢抗山羊IgG H&L(Alexa Fluor?488)(ab150129),驢抗兔 IgG H&L(Alexa Fluor?647),英國(guó)Abcam公司;Iba1抗體(NB100-1028),Novus Biologicals;BDNF抗體(PB9075),TrkB抗體(BM4759),武漢博士德生物工程有限公司;β-actin抗體(GB15001),武漢賽維爾生物科技有限公司;GABAA Rα(sc-376282),圣克魯斯生物技術(shù);HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG H&L(A0208),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;2,3,5氯化三苯基四氮唑TTC(T8170),尼氏染色試劑盒(G1432),北京索萊寶科技有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 動(dòng)物分組和造模 腦卒中后中樞性疼痛動(dòng)物模型的造模方法參考HYAKKOKU等[8]的造模方法并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SHAM組)10只,腦卒中模型組(CPSP組)50只。術(shù)前1 d運(yùn)用熱板法測(cè)定大鼠熱痛閾值,作為基礎(chǔ)痛閾值。采用大腦中動(dòng)脈阻塞線栓法(MCAO)建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型,沿右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓并向前推進(jìn),直至大腦中動(dòng)脈起始部被阻斷,60 min后緩慢拔除線栓,恢復(fù)供血,造成腦卒中模型,假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈。造模后兩小時(shí)參照Z(yǔ)ea Longa評(píng)分法評(píng)估模型[9],評(píng)分為1~3分的大鼠視為腦卒中造模成功,術(shù)后3 d再次測(cè)定熱痛閾,以術(shù)前1 d測(cè)量值為參考值,篩選出熱痛閾下降超過(guò)50%的大鼠[10],納入模型組(CPSP)。
1.2.2 大鼠熱痛閾測(cè)定 利用熱板法測(cè)定各組大鼠術(shù)前1 d、術(shù)后3、7、14、21、28 d熱痛閾值,將大鼠置于50℃的熱板儀上,以30 s為上限值,以舔后足或連續(xù)縮足為觀察指標(biāo),測(cè)試完畢,將大鼠放回籠中,間隔至少15 min后重復(fù)測(cè)試,測(cè)定3次,取后兩次平均值為熱痛閾值[11]。
1.2.3 腦組織TTC染色、HE染色和尼氏染色 術(shù)后3 d,從模型組和假手術(shù)組隨機(jī)選取1只大鼠處死,取其腦組織,-40℃冰箱冰凍10 min,棄去腦干,每2 mm切一片,切成均勻的6~7片,室溫避光用2%的TTC染液,室溫避光處理30 min,后用4%多聚甲醛固定24 h,拍照采集圖像[12]。術(shù)后28 d處死大鼠取其腦組織,4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水后石蠟包埋切成5 μm薄片,固定于載玻片上,烘烤后,二甲苯脫蠟透明,梯度酒精水化,部分切片進(jìn)行HE染色[13],蘇木素染色5 min,鹽酸酒精分化,氨水返藍(lán),伊紅染色1 min,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,鏡下觀察;另一部分切片進(jìn)行尼氏染色[14],60℃尼氏染液染色30 min,95%酒精脫色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,鏡下觀察,對(duì)丘腦VPL區(qū)尼氏體進(jìn)行計(jì)數(shù)。
1.2.4 Neun免疫組化檢測(cè)和IBA1、BDNF免疫熒光檢測(cè) 術(shù)后28 d處死大鼠取其腦組織,4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水后石蠟包埋切成5 μm薄片,固定于載玻片上,烘烤后,二甲苯脫蠟透明,梯度酒精水化,部分切片進(jìn)行Neun免疫組化檢測(cè),檸檬酸鈉熱修復(fù),滅活內(nèi)源過(guò)氧化酶,山羊血清封閉后,滴加兔源Neun(1∶200)4℃過(guò)夜孵育,洗去一抗后,37℃孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶50)30 min,DAB避光顯色,蘇木素復(fù)染后脫水封片。鏡下觀察并采集圖片,使用Image J分析平均光密度值。另一部分切片進(jìn)行IBA1、BDNF免疫熒光檢測(cè)檸檬酸鈉熱修復(fù),TritonX-100破膜,驢血清封閉,滴加山羊源 IBA1(1∶1 000)和兔源BDNF(1∶200)4℃過(guò)夜孵育,洗去一抗后,室溫孵育驢抗山羊和驢抗兔熒光二抗(1∶1 000)2 h,DAPI染核,抗熒光淬滅封片劑封片,鏡下觀察并采集圖片。
1.2.5 Western blot檢測(cè)丘腦 BDNF,TRKB 和GABAAR蛋白的表達(dá) 術(shù)后28 d處死大鼠取丘腦組織,-80℃冷藏,加入裂解液后剪碎,提取總蛋白,BCA蛋白定量,100℃5 min使蛋白變性,取一定量的蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳,電轉(zhuǎn)至0.45 nm PVDF膜上后,5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗4℃孵育過(guò)夜,恢復(fù)室溫,TBST洗膜5次,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜5次,加入ECL熒光顯色。采用Image J軟件進(jìn)行結(jié)果分析。
1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,研究結(jié)果計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖形用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行繪制,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 腦卒中模型評(píng)價(jià) TTC染色結(jié)果如圖1、表1所示,正常大鼠腦組織被染成紅色,梗死腦組織被染成白色,與假手術(shù)組相比,模型組丘腦VPL區(qū)可見(jiàn)明顯白色梗死區(qū),涉及疼痛處理的腦區(qū)在tMCAO術(shù)后3 d受到損傷,證明tMCAO模型可以損傷大鼠丘腦。造模后,CPSP組與SHAM組相比神經(jīng)功能評(píng)分升高,大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷,腦卒中模型造模成功。
表1 腦梗死面積與神經(jīng)功能評(píng)分值Tab.1 Infarction area and Neurological deficit scores ±s
表1 腦梗死面積與神經(jīng)功能評(píng)分值Tab.1 Infarction area and Neurological deficit scores ±s
注:與SHAM組比較,*P<0.05
組別SHAM組CPSP組腦梗死面積(cm2)0 5.52神經(jīng)功能評(píng)分值(分)0 2.14±0.69*
圖1 腦卒中造模結(jié)果Fig.1 Results of stroke modeling
2.2 MCAO術(shù)后大鼠熱痛閾變化 50只大鼠進(jìn)行MCAO造模后,術(shù)后死亡14只,共36只存活,大鼠熱痛閾值的變化如圖2、表2所示,術(shù)前各組大鼠熱痛閾差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MCAO造模后,11只大鼠出現(xiàn)熱痛閾下降的情況,發(fā)病率為30.55%,與臨床發(fā)病率一致[15],將其納入CPSP組,測(cè)定其術(shù)后熱痛閾值,結(jié)果表明術(shù)后因MCAO導(dǎo)致的大鼠熱痛閾下降癥狀持續(xù)了至少28 d。
表2 MCAO術(shù)后大鼠熱痛閾變化Tab.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO ±s
表2 MCAO術(shù)后大鼠熱痛閾變化Tab.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO ±s
注:與SHAM組比較,*P<0.05;與SHAM組比較,**P<0.01;與SHAM組比較,***P<0.001
組別SHAM組CPSP組術(shù)前1 d 19.88±3.45 18.88±2.6術(shù)后3 d 20.62±2.89 8.73±3.27***術(shù)后7 d 21.41±3.53 9.84±2.45***術(shù)后14 d 17.89±1.44 10.5±2.33***術(shù)后21 d 15.93±3.94 10.2±2.79*術(shù)后28 d 17.39±4.33 9.97±2.59**
圖2 MCAO術(shù)后大鼠熱痛閾變化Fig.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO
2.3 丘腦HE染色、尼氏染色、Neun免疫組化染色 大鼠丘腦VPL區(qū)的病理?yè)p傷如圖3、表3所示,尼氏染色結(jié)果顯示,SHAM組大鼠丘腦VPL區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)則,胞體較大,呈椎體形或橢圓形,CPSP組丘腦VPL區(qū)正常神經(jīng)元排列紊亂,尼氏體數(shù)量減少,染色變淺,尼氏體數(shù)量顯著降低(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示,SHAM組腦組織均勻,神經(jīng)元排列整齊、致密,胞核無(wú)固縮、變形,CPSP組腦組織損傷明顯,可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)排列紊亂,細(xì)胞核形態(tài)紊亂,大量神經(jīng)元細(xì)胞固縮,胞核消失。Neun免疫組化染色結(jié)果顯示,與SHAM組相比,CPSP組丘腦VPL區(qū)Neun陽(yáng)性表達(dá)顯著減少,平均光密度值顯著降低(P<0.05)。
表3 尼氏體計(jì)數(shù)和Neun免疫組化平均光密度值Tab.3 The number of Nissl bodies and average optical density value of IHC ±s
表3 尼氏體計(jì)數(shù)和Neun免疫組化平均光密度值Tab.3 The number of Nissl bodies and average optical density value of IHC ±s
注:與SHAM組比較,*P<0.05,***P<0.001
組別SHAM組CPSP組尼氏體計(jì)數(shù)/mm2 233.57±10.65 142.29±8.38***Neun免疫組化平均光密度值146.24±5.44 135.65±3.41*
圖3 丘腦VPL區(qū)尼氏染色、HE染色和Neun免疫組化染色Fig.3 The pathological changes of rat thalamus(VPL)
2.4 丘腦BDNF、iba1免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光結(jié)果如表4、圖4所示,丘腦VPL區(qū)存在小膠質(zhì)細(xì)胞與BDNF共表達(dá),與SHAM組相比,CPSP組丘腦VPL區(qū)iba1與BDNF陽(yáng)性表達(dá)增多。表明小膠質(zhì)細(xì)胞激活后分泌的BDNF可能與MCAO術(shù)后的痛覺(jué)過(guò)敏有關(guān)。
圖4 丘腦BDNF、iba1免疫熒光染色結(jié)果Fig.4 Results of IBA1 and BDNF immunofluorescence measurement
表4 丘腦BDNF、iba1陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)Tab.4 Numbers of iba1+and BDNF+cells ±s,個(gè)/mm2
表4 丘腦BDNF、iba1陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)Tab.4 Numbers of iba1+and BDNF+cells ±s,個(gè)/mm2
注:與SHAM組比較,***P<0.001
組別SHAM組CPSP組iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)109.72±21.38 158.4±20.67***BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)308.33±23.20 433.58±16.28***
2.5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達(dá)結(jié)果 大鼠丘腦BDNF、TRKB、GABAAR蛋白表達(dá)的結(jié)果如表5、圖5所示,與SHAM組相比,CPSP組大鼠BDNF、TRKB蛋白含量顯著升高(P<0.05),GABAAR蛋白含量顯著降低(P<0.05)。
表5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達(dá)結(jié)果Tab.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR ±s
表5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達(dá)結(jié)果Tab.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR ±s
注:與SHAM組比較,**P<0.01,***P<0.001
組別SHAM組CPSP組BDNF 0.69±0.01 1.31±0.01***TrkB 0.77±0.07 1.24±0.07**GABAAR 1.13±0.09 0.71±0.07**
圖5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR
腦卒中后中樞性疼痛是腦卒中后一種常見(jiàn)的并發(fā)癥,發(fā)病機(jī)制尚不明確,是腦卒中并發(fā)癥中研究較少的一種并發(fā)癥,痛覺(jué)過(guò)敏是腦卒中后中樞性疼痛的主要癥狀之一[16]。HYAKKOKU 等[8]和TAKAMI等[17]證明tMCAO可以引起大鼠和小鼠的疼痛傳導(dǎo)纖維Aδ和Aβ纖維發(fā)生變化,可能與CPSP的發(fā)病機(jī)制有關(guān),但并未對(duì)其深入研究。本研究采用tMCAO復(fù)制大鼠腦卒中缺血再灌注模型,運(yùn)用神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行模型評(píng)價(jià),同時(shí)使用熱板法對(duì)腦卒中模型大鼠術(shù)前術(shù)后的熱痛閾進(jìn)行測(cè)定,觀察大鼠術(shù)后熱痛閾值的變化。結(jié)果表明,MCAO術(shù)后,大鼠神經(jīng)功能評(píng)分升高,大鼠腦卒中模型復(fù)制成功;熱板法結(jié)果顯示,腦卒中模型大鼠術(shù)后有一部分出現(xiàn)了痛覺(jué)過(guò)敏的癥狀,且與臨床腦卒中后中樞性疼痛的發(fā)病率相似[15],表明通過(guò)tMCAO可以成功建立起CPSP動(dòng)物模型。
丘腦是疼痛傳導(dǎo)通路中的重要組成部分,有研究表明約有50%左右CPSP患者存在丘腦損傷[18],尤其是丘腦腹外側(cè)核的損傷[19],極有可能引起腦卒中后中樞性疼痛的發(fā)生。目前絕大多數(shù)關(guān)于CPSP的研究均定位于丘腦的功能障礙上,尤其是腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛傳導(dǎo)通路中興奮與抑制的失衡,具體表現(xiàn)為中樞敏化和去抑制[20]。本研究首先使用了TTC染色評(píng)估tMCAO造模后大鼠術(shù)后3 d的腦梗死面積,在明確丘腦腹外側(cè)核存在損傷后,通過(guò)尼氏染色、HE染色和Neun免疫組化染色進(jìn)一步考察丘腦的損傷,結(jié)果表明與SHAM組相比,CPSP組丘腦VPL區(qū)組織損傷明顯,尼氏體數(shù)量減少,Neun陽(yáng)性表達(dá)降低,表明腦卒中后中樞性疼痛模型大鼠丘腦VPL區(qū)出現(xiàn)損傷。
腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic bactor,BDNF)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)生長(zhǎng)因子,研究表明,BDNF的異常表達(dá)與痛覺(jué)過(guò)敏有著密切聯(lián)系[21],在神經(jīng)病理性疼痛中,脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中的BDNF表達(dá)升高,BDNF激活其受體TrkB,降低K+/Cl-突觸后轉(zhuǎn)運(yùn)體(KCC2)的表達(dá)[22],導(dǎo)致Cl-外排減少,而 GABA 的中樞抑制性功能的發(fā)揮主要依賴于激活離子型GABAA受體引起的Cl-內(nèi)流,KCC2的表達(dá)降低嚴(yán)重影響了GABA的中樞抑制性功能[23],最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氯離子含量的升高,中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制的失衡,脊髓背角神經(jīng)元興奮性升高,最終導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活密切參與痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)展[24],神經(jīng)損傷后,受損的初級(jí)傳入神經(jīng)釋放趨化因子、信號(hào)分子和蛋白酶激活脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞中的BDNF表達(dá)升高,從而增強(qiáng)脊髓傷害感受回路的興奮性[25]。本研究采用了免疫熒光染色檢測(cè)了丘腦VPL區(qū)丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與BDNF的表達(dá),同時(shí)運(yùn)用Western blot檢測(cè)了丘腦BDNF、TrkB的蛋白表達(dá),結(jié)果表明與SHAM組相比,CPSP組丘腦VPL區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量與BDNF表達(dá)增加,且出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞與BDNF共表達(dá)現(xiàn)象,Western blot結(jié)果顯示,與SHAM組相比,丘腦BDNF、TrkB表達(dá)顯著增加,表明腦卒中后中樞性疼痛模型大鼠丘腦BDNF、TrkB表達(dá)增加,且增加表達(dá)的BDNF是與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。此外本研究發(fā)現(xiàn)與SHAM組相比,CPSP組丘腦GABAAR表達(dá)顯著降低,表明丘腦內(nèi)除了受到BDNF/TrkB間接導(dǎo)致的GABA抑制功能減弱外,GABAAR的表達(dá)量降低將直接導(dǎo)致GABA抑制功能降低,中樞去抑制。目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道此現(xiàn)象,GABAAR有可能是腦卒中后中樞性疼痛發(fā)病機(jī)制中的另一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
綜上所述,本研究利用免疫熒光技術(shù)和Western blot技術(shù)對(duì)腦卒后中樞性疼痛模型大鼠丘腦的小膠質(zhì)細(xì)胞,BDNF,TRKB,GABAAR含量進(jìn)行了研究,結(jié)果表明腦卒后中樞性疼痛模型大鼠丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加,BDNF,TRKB蛋白表達(dá)增加,GABAAR含量減少,丘腦內(nèi)疼痛傳導(dǎo)信號(hào)興奮與抑制平衡被打破,提示丘腦內(nèi)BDNF的升高可能是腦卒中后中樞性疼痛發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié),可能為腦卒中后中樞性疼痛提供新的治療靶點(diǎn)和治療措施。