金博文 李東娜 莊朋偉 郭虹 張艷軍

1天津中醫(yī)藥大學(xué)（天津 301617）；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（天津 300193）

腦卒中后中樞性疼痛（central post-stroke pain，CPSP）是繼發(fā)于腦卒中之后的慢性中樞性神經(jīng)病理性疼痛，其臨床癥狀主要為卒中后自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏和感覺(jué)異常［1］，是導(dǎo)致患者腦卒中后焦慮抑郁的主要原因之一，嚴(yán)重影響了患者卒中后恢復(fù)期的生存質(zhì)量［2］。隨著腦卒中發(fā)病率和存活率的逐年上升［3］，CPSP患者數(shù)量逐漸增加，目前關(guān)于CPSP發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在神經(jīng)炎癥、中樞敏化和去抑制三個(gè)方面［4］，盡管近年來(lái)取得了一定進(jìn)展，但CPSP的發(fā)病機(jī)制仍不完全明確，對(duì)臨床有效藥物的研發(fā)帶來(lái)了一定困難。

腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brain-derived neurotrophic bactor，BDNF）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在的一種基礎(chǔ)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白［5］。BDNF與其受體酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）結(jié)合后，自身產(chǎn)生磷酸化，經(jīng)過(guò)磷酸化的TrkB可激活下游多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑而發(fā)揮生物學(xué)功能［6］，研究表明，慢性疼痛過(guò)程中BDNF-TrkB通路的異常激活與痛覺(jué)過(guò)敏有著密切聯(lián)系［7］，是疼痛傳導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但關(guān)于BDNF在腦卒后中樞性疼痛的發(fā)病過(guò)程中起到的作用，目前尚無(wú)研究。本研究擬基于丘腦BDNF信號(hào)揭示腦卒中后中樞性疼痛的發(fā)病機(jī)制，為腦卒中后中樞性疼痛的防治提供一定線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 大鼠MCAO線栓（2838A5），北京西濃科技有限公司；小動(dòng)物麻醉機(jī)，美國(guó)Matrx公司；石蠟包埋機(jī)，轉(zhuǎn)輪切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；電泳槽，美國(guó)伯樂(lè)公司；凝膠成像儀，和信偉業(yè)科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡雄性wistar大鼠60只，體質(zhì)量270～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.3 試劑 Neun抗體（ab177487），驢抗山羊IgG H&L（Alexa Fluor?488）（ab150129），驢抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor?647），英國(guó)Abcam公司；Iba1抗體（NB100-1028），Novus Biologicals；BDNF抗體（PB9075），TrkB抗體（BM4759），武漢博士德生物工程有限公司；β-actin抗體（GB15001），武漢賽維爾生物科技有限公司；GABAA Rα（sc-376282），圣克魯斯生物技術(shù)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG H&L（A0208），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2，3，5氯化三苯基四氮唑TTC（T8170），尼氏染色試劑盒（G1432），北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和造模 腦卒中后中樞性疼痛動(dòng)物模型的造模方法參考HYAKKOKU等［8］的造模方法并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM組）10只，腦卒中模型組（CPSP組）50只。術(shù)前1 d運(yùn)用熱板法測(cè)定大鼠熱痛閾值，作為基礎(chǔ)痛閾值。采用大腦中動(dòng)脈阻塞線栓法（MCAO）建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，沿右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓并向前推進(jìn)，直至大腦中動(dòng)脈起始部被阻斷，60 min后緩慢拔除線栓，恢復(fù)供血，造成腦卒中模型，假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈。造模后兩小時(shí)參照Z(yǔ)ea Longa評(píng)分法評(píng)估模型［9］，評(píng)分為1～3分的大鼠視為腦卒中造模成功，術(shù)后3 d再次測(cè)定熱痛閾，以術(shù)前1 d測(cè)量值為參考值，篩選出熱痛閾下降超過(guò)50%的大鼠［10］，納入模型組（CPSP）。

1.2.2 大鼠熱痛閾測(cè)定 利用熱板法測(cè)定各組大鼠術(shù)前1 d、術(shù)后3、7、14、21、28 d熱痛閾值，將大鼠置于50℃的熱板儀上，以30 s為上限值，以舔后足或連續(xù)縮足為觀察指標(biāo)，測(cè)試完畢，將大鼠放回籠中，間隔至少15 min后重復(fù)測(cè)試，測(cè)定3次，取后兩次平均值為熱痛閾值［11］。

1.2.3 腦組織TTC染色、HE染色和尼氏染色 術(shù)后3 d，從模型組和假手術(shù)組隨機(jī)選取1只大鼠處死，取其腦組織，-40℃冰箱冰凍10 min，棄去腦干，每2 mm切一片，切成均勻的6～7片，室溫避光用2%的TTC染液，室溫避光處理30 min，后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照采集圖像［12］。術(shù)后28 d處死大鼠取其腦組織，4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水后石蠟包埋切成5 μm薄片，固定于載玻片上，烘烤后，二甲苯脫蠟透明，梯度酒精水化，部分切片進(jìn)行HE染色［13］，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，伊紅染色1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察；另一部分切片進(jìn)行尼氏染色［14］，60℃尼氏染液染色30 min，95%酒精脫色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察，對(duì)丘腦VPL區(qū)尼氏體進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 Neun免疫組化檢測(cè)和IBA1、BDNF免疫熒光檢測(cè) 術(shù)后28 d處死大鼠取其腦組織，4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水后石蠟包埋切成5 μm薄片，固定于載玻片上，烘烤后，二甲苯脫蠟透明，梯度酒精水化，部分切片進(jìn)行Neun免疫組化檢測(cè)，檸檬酸鈉熱修復(fù)，滅活內(nèi)源過(guò)氧化酶，山羊血清封閉后，滴加兔源Neun（1∶200）4℃過(guò)夜孵育，洗去一抗后，37℃孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶50）30 min，DAB避光顯色，蘇木素復(fù)染后脫水封片。鏡下觀察并采集圖片，使用Image J分析平均光密度值。另一部分切片進(jìn)行IBA1、BDNF免疫熒光檢測(cè)檸檬酸鈉熱修復(fù)，TritonX-100破膜，驢血清封閉，滴加山羊源 IBA1（1∶1 000）和兔源BDNF（1∶200）4℃過(guò)夜孵育，洗去一抗后，室溫孵育驢抗山羊和驢抗兔熒光二抗（1∶1 000）2 h，DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察并采集圖片。

1.2.5 Western blot檢測(cè)丘腦 BDNF，TRKB 和GABAAR蛋白的表達(dá) 術(shù)后28 d處死大鼠取丘腦組織，-80℃冷藏，加入裂解液后剪碎，提取總蛋白，BCA蛋白定量，100℃5 min使蛋白變性，取一定量的蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至0.45 nm PVDF膜上后，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，恢復(fù)室溫，TBST洗膜5次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜5次，加入ECL熒光顯色。采用Image J軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究結(jié)果計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖形用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行繪制，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦卒中模型評(píng)價(jià) TTC染色結(jié)果如圖1、表1所示，正常大鼠腦組織被染成紅色，梗死腦組織被染成白色，與假手術(shù)組相比，模型組丘腦VPL區(qū)可見(jiàn)明顯白色梗死區(qū)，涉及疼痛處理的腦區(qū)在tMCAO術(shù)后3 d受到損傷，證明tMCAO模型可以損傷大鼠丘腦。造模后，CPSP組與SHAM組相比神經(jīng)功能評(píng)分升高，大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷，腦卒中模型造模成功。

表1 腦梗死面積與神經(jīng)功能評(píng)分值Tab.1 Infarction area and Neurological deficit scores ±s

表1 腦梗死面積與神經(jīng)功能評(píng)分值Tab.1 Infarction area and Neurological deficit scores ±s

注：與SHAM組比較，*P＜0.05

組別SHAM組CPSP組腦梗死面積（cm2）0 5.52神經(jīng)功能評(píng)分值（分）0 2.14±0.69*

圖1 腦卒中造模結(jié)果Fig.1 Results of stroke modeling

2.2 MCAO術(shù)后大鼠熱痛閾變化 50只大鼠進(jìn)行MCAO造模后，術(shù)后死亡14只，共36只存活，大鼠熱痛閾值的變化如圖2、表2所示，術(shù)前各組大鼠熱痛閾差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MCAO造模后，11只大鼠出現(xiàn)熱痛閾下降的情況，發(fā)病率為30.55%，與臨床發(fā)病率一致［15］，將其納入CPSP組，測(cè)定其術(shù)后熱痛閾值，結(jié)果表明術(shù)后因MCAO導(dǎo)致的大鼠熱痛閾下降癥狀持續(xù)了至少28 d。

表2 MCAO術(shù)后大鼠熱痛閾變化Tab.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO ±s

表2 MCAO術(shù)后大鼠熱痛閾變化Tab.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO ±s

注：與SHAM組比較，*P＜0.05；與SHAM組比較，**P＜0.01；與SHAM組比較，***P＜0.001

組別SHAM組CPSP組術(shù)前1 d 19.88±3.45 18.88±2.6術(shù)后3 d 20.62±2.89 8.73±3.27***術(shù)后7 d 21.41±3.53 9.84±2.45***術(shù)后14 d 17.89±1.44 10.5±2.33***術(shù)后21 d 15.93±3.94 10.2±2.79*術(shù)后28 d 17.39±4.33 9.97±2.59**

圖2 MCAO術(shù)后大鼠熱痛閾變化Fig.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO

2.3 丘腦HE染色、尼氏染色、Neun免疫組化染色 大鼠丘腦VPL區(qū)的病理?yè)p傷如圖3、表3所示，尼氏染色結(jié)果顯示，SHAM組大鼠丘腦VPL區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)則，胞體較大，呈椎體形或橢圓形，CPSP組丘腦VPL區(qū)正常神經(jīng)元排列紊亂，尼氏體數(shù)量減少，染色變淺，尼氏體數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示，SHAM組腦組織均勻，神經(jīng)元排列整齊、致密，胞核無(wú)固縮、變形，CPSP組腦組織損傷明顯，可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，細(xì)胞核形態(tài)紊亂，大量神經(jīng)元細(xì)胞固縮，胞核消失。Neun免疫組化染色結(jié)果顯示，與SHAM組相比，CPSP組丘腦VPL區(qū)Neun陽(yáng)性表達(dá)顯著減少，平均光密度值顯著降低（P＜0.05）。

表3 尼氏體計(jì)數(shù)和Neun免疫組化平均光密度值Tab.3 The number of Nissl bodies and average optical density value of IHC ±s

表3 尼氏體計(jì)數(shù)和Neun免疫組化平均光密度值Tab.3 The number of Nissl bodies and average optical density value of IHC ±s

注：與SHAM組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

組別SHAM組CPSP組尼氏體計(jì)數(shù)/mm2 233.57±10.65 142.29±8.38***Neun免疫組化平均光密度值146.24±5.44 135.65±3.41*

圖3 丘腦VPL區(qū)尼氏染色、HE染色和Neun免疫組化染色Fig.3 The pathological changes of rat thalamus（VPL）

2.4 丘腦BDNF、iba1免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光結(jié)果如表4、圖4所示，丘腦VPL區(qū)存在小膠質(zhì)細(xì)胞與BDNF共表達(dá)，與SHAM組相比，CPSP組丘腦VPL區(qū)iba1與BDNF陽(yáng)性表達(dá)增多。表明小膠質(zhì)細(xì)胞激活后分泌的BDNF可能與MCAO術(shù)后的痛覺(jué)過(guò)敏有關(guān)。

圖4 丘腦BDNF、iba1免疫熒光染色結(jié)果Fig.4 Results of IBA1 and BDNF immunofluorescence measurement

表4 丘腦BDNF、iba1陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)Tab.4 Numbers of iba1+and BDNF+cells ±s，個(gè)/mm2

表4 丘腦BDNF、iba1陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)Tab.4 Numbers of iba1+and BDNF+cells ±s，個(gè)/mm2

注：與SHAM組比較，***P＜0.001

組別SHAM組CPSP組iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)109.72±21.38 158.4±20.67***BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)308.33±23.20 433.58±16.28***

2.5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達(dá)結(jié)果 大鼠丘腦BDNF、TRKB、GABAAR蛋白表達(dá)的結(jié)果如表5、圖5所示，與SHAM組相比，CPSP組大鼠BDNF、TRKB蛋白含量顯著升高（P＜0.05），GABAAR蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。

表5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達(dá)結(jié)果Tab.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR ±s

表5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達(dá)結(jié)果Tab.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR ±s

注：與SHAM組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

組別SHAM組CPSP組BDNF 0.69±0.01 1.31±0.01***TrkB 0.77±0.07 1.24±0.07**GABAAR 1.13±0.09 0.71±0.07**

圖5 丘腦BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR

3 討論

腦卒中后中樞性疼痛是腦卒中后一種常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制尚不明確，是腦卒中并發(fā)癥中研究較少的一種并發(fā)癥，痛覺(jué)過(guò)敏是腦卒中后中樞性疼痛的主要癥狀之一［16］。HYAKKOKU 等［8］和TAKAMI等［17］證明tMCAO可以引起大鼠和小鼠的疼痛傳導(dǎo)纖維Aδ和Aβ纖維發(fā)生變化，可能與CPSP的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，但并未對(duì)其深入研究。本研究采用tMCAO復(fù)制大鼠腦卒中缺血再灌注模型，運(yùn)用神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行模型評(píng)價(jià)，同時(shí)使用熱板法對(duì)腦卒中模型大鼠術(shù)前術(shù)后的熱痛閾進(jìn)行測(cè)定，觀察大鼠術(shù)后熱痛閾值的變化。結(jié)果表明，MCAO術(shù)后，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分升高，大鼠腦卒中模型復(fù)制成功；熱板法結(jié)果顯示，腦卒中模型大鼠術(shù)后有一部分出現(xiàn)了痛覺(jué)過(guò)敏的癥狀，且與臨床腦卒中后中樞性疼痛的發(fā)病率相似［15］，表明通過(guò)tMCAO可以成功建立起CPSP動(dòng)物模型。

丘腦是疼痛傳導(dǎo)通路中的重要組成部分，有研究表明約有50%左右CPSP患者存在丘腦損傷［18］，尤其是丘腦腹外側(cè)核的損傷［19］，極有可能引起腦卒中后中樞性疼痛的發(fā)生。目前絕大多數(shù)關(guān)于CPSP的研究均定位于丘腦的功能障礙上，尤其是腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛傳導(dǎo)通路中興奮與抑制的失衡，具體表現(xiàn)為中樞敏化和去抑制［20］。本研究首先使用了TTC染色評(píng)估tMCAO造模后大鼠術(shù)后3 d的腦梗死面積，在明確丘腦腹外側(cè)核存在損傷后，通過(guò)尼氏染色、HE染色和Neun免疫組化染色進(jìn)一步考察丘腦的損傷，結(jié)果表明與SHAM組相比，CPSP組丘腦VPL區(qū)組織損傷明顯，尼氏體數(shù)量減少，Neun陽(yáng)性表達(dá)降低，表明腦卒中后中樞性疼痛模型大鼠丘腦VPL區(qū)出現(xiàn)損傷。

腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brain-derived neurotrophic bactor，BDNF）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，研究表明，BDNF的異常表達(dá)與痛覺(jué)過(guò)敏有著密切聯(lián)系［21］，在神經(jīng)病理性疼痛中，脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中的BDNF表達(dá)升高，BDNF激活其受體TrkB，降低K+/Cl-突觸后轉(zhuǎn)運(yùn)體（KCC2）的表達(dá)［22］，導(dǎo)致Cl-外排減少，而 GABA 的中樞抑制性功能的發(fā)揮主要依賴于激活離子型GABAA受體引起的Cl-內(nèi)流，KCC2的表達(dá)降低嚴(yán)重影響了GABA的中樞抑制性功能［23］，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氯離子含量的升高，中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制的失衡，脊髓背角神經(jīng)元興奮性升高，最終導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活密切參與痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)展［24］，神經(jīng)損傷后，受損的初級(jí)傳入神經(jīng)釋放趨化因子、信號(hào)分子和蛋白酶激活脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞中的BDNF表達(dá)升高，從而增強(qiáng)脊髓傷害感受回路的興奮性［25］。本研究采用了免疫熒光染色檢測(cè)了丘腦VPL區(qū)丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與BDNF的表達(dá)，同時(shí)運(yùn)用Western blot檢測(cè)了丘腦BDNF、TrkB的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明與SHAM組相比，CPSP組丘腦VPL區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量與BDNF表達(dá)增加，且出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞與BDNF共表達(dá)現(xiàn)象，Western blot結(jié)果顯示，與SHAM組相比，丘腦BDNF、TrkB表達(dá)顯著增加，表明腦卒中后中樞性疼痛模型大鼠丘腦BDNF、TrkB表達(dá)增加，且增加表達(dá)的BDNF是與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。此外本研究發(fā)現(xiàn)與SHAM組相比，CPSP組丘腦GABAAR表達(dá)顯著降低，表明丘腦內(nèi)除了受到BDNF/TrkB間接導(dǎo)致的GABA抑制功能減弱外，GABAAR的表達(dá)量降低將直接導(dǎo)致GABA抑制功能降低，中樞去抑制。目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道此現(xiàn)象，GABAAR有可能是腦卒中后中樞性疼痛發(fā)病機(jī)制中的另一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

綜上所述，本研究利用免疫熒光技術(shù)和Western blot技術(shù)對(duì)腦卒后中樞性疼痛模型大鼠丘腦的小膠質(zhì)細(xì)胞，BDNF，TRKB，GABAAR含量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明腦卒后中樞性疼痛模型大鼠丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，BDNF，TRKB蛋白表達(dá)增加，GABAAR含量減少，丘腦內(nèi)疼痛傳導(dǎo)信號(hào)興奮與抑制平衡被打破，提示丘腦內(nèi)BDNF的升高可能是腦卒中后中樞性疼痛發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，可能為腦卒中后中樞性疼痛提供新的治療靶點(diǎn)和治療措施。