胡琳 楊艷娟 李潔瀅 周忠 田正 焦蓉

湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院兒科（湖北 襄陽 441000）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種好發(fā)于5歲以下兒童的免疫性血管炎，若未得到及時的治療，可發(fā)生多種并發(fā)癥，其中最嚴重的是冠狀動脈損傷（coronary arterylesion，CAL），其病因及發(fā)病機制尚未明確，目前的研究提示可能與感染、血管內(nèi)皮損傷等因素有關［1-2］。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路參與細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導途徑，也參與炎癥及氧化應激的調(diào)控［3］，郭鑫等［4］認為PI3K/Akt信號通路激活后對KD冠狀動脈內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路在KD中起著很重要的作用，該通路的激活可產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應引起細胞因子風暴，可促使炎癥因子如白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-8（IL-8）及黏附分子如血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等的產(chǎn)生，并介導中性粒細胞的聚集、浸潤，血管通透性增加，最終導致冠狀動脈損傷［5-7］。氧化應激與很多疾病的發(fā)生有關，與人體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡之中，若這種平衡關系被破壞就會產(chǎn)生氧化應激損傷，導致活性氧（ROS）過度表達及抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，進一步導致血管內(nèi)皮細胞功能異常［8］。因此，減輕急性期炎癥反應、保護血管內(nèi)皮結構和功能完整或許對KD合并CAL的防治有一定的幫助。

目前KD的經(jīng)典治療方案是丙種球蛋白和阿司匹林聯(lián)合用藥，但仍有部分患者對丙種球蛋白治療無反應［9-10］，因此尋找輔助治療藥物極為重要，有學者建議使用天然藥物作為川崎病的輔助治療［11］。

紅景天苷（Salidroside，Sal）是植物紅景天的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等多種特點，可通過抑制炎癥、氧化應激等發(fā)揮保護內(nèi)皮功能的作用［12］。盡管紅景天苷有如此多的生物學作用，但在KD中紅景天苷是否可以通過PI3K/Akt和NF-κB信號通路減輕炎癥反應和氧化應激水平發(fā)揮冠狀動脈保護作用尚未見相關報道。

依據(jù)目前國內(nèi)外已建立的KD內(nèi)皮細胞模型［13-14］，本研究將沿用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導人冠狀動脈內(nèi)皮細胞（HCAEC）這一方法來建立KD冠狀動脈損傷細胞模型，并探討紅景天苷對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞（HCAEC）炎癥反應和氧化應激損傷的保護作用及其機制，期望為川崎病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HCAEC細胞購自于Otwo Biotech；TNF-α購自于Pepro Tech；Sal購自MCE；高糖DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；CCK-8試劑盒購自Biosharp；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒購自Takara；ROS檢測試劑盒購自Solarbio，SOD及GSH-px分析試劑盒購自南京建成；抗p-PI3K85（Bioss）；抗 p-NF-κBp65（Wanleibio）；抗 p-Akt（Affinity）；抗IL-6、IL-1β、ZO-1及VE-cadherin（Proteintech）。引物設計及合成由武漢金開瑞生物工程有限公司完成。本研究已經(jīng)過湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會審批（審查批號：XYYYE20210030號）

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 在HCAEC中加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔24 h進行換液，每3天傳代一次。將對數(shù)生長期的HCAEC細胞隨機分為Con組、TNF-α組、TNF-α+50 μmol/L Sal組、TNF-α+100 μmol/L Sal組。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖活性 將HCAEC（1×104/mL）接種在96孔板中，每孔100 μL。設置不同濃度梯度的紅景天苷（12.5、25、50、100、200 μmol/L）作用24 h，或 TNF-α（5、10、20、40、80 ng/mL）作用6 h，并設立空白對照，每組5個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標儀450 nm處測定吸光度值，計算細胞增殖率。

1.4 RT-qPCR法檢測細胞炎癥因子及黏附分子mRNA的表達情況 將HCAEC（1×106/mL）接種于6孔板中，先用40 ng/mL的TNF-α處理細胞6 h，再加或不加50 μmol/L和100 μmol/L的紅景天苷處理24 h，用Trizol試劑提取總RNA，取1 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA取2 μL為模板進行PCR。以2-ΔΔCT法進行相對定量分析。實驗中使用的引物見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.5 Western blot法檢測PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的表達情況 按照上述方法鋪板、處理細胞，采用RIPA細胞裂解液于冰浴上提取總蛋白，BCA法定量，加入loadding buffer煮沸10 min。取25 μg等量蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)入PVDF膜，用5%脫脂奶粉進行封閉1.5 h，分別加入一抗（β-actin、p-PI3K、p-Akt、p-P65、VE-cadherin、ZO-1、IL-1β、IL-6）4 ℃孵育過夜后，用TBST漂洗3次，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，用TBST洗滌3次，加入ECL發(fā)光顯影，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析目的蛋白條帶相對分子質(zhì)量及灰度值。

1.6 DCFH-DA法觀察細胞ROS生成情況 將HCAEC細胞以2×104個/孔的密度接種于24孔板中，按照上述方法處理細胞，添加2'-7'-二氯二醋酸熒光素（DCFH-DA），在CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min，用PBS洗滌細胞3次，在熒光顯微鏡（200×）下觀察綠色熒光，采集圖像并分析各組熒光強度。

1.7 檢測細胞上清液中SOD、GSH-px的活性 將HCAEC細胞以100×104個/孔的密度接種于40 mm培養(yǎng)皿中，按照上述方法處理細胞，收集細胞上清，按照試劑盒說明書檢測各組細胞SOD、GSH-Px活性。

1.8 統(tǒng)計學方法 本文所有實驗均重復3次，采用Graphpad 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紅景天苷及TNF-α對HCAEC增殖活性的影響 CCK-8結果顯示，與對照組相比，12.5、25、50、100 μmol/L的Sal對HCAEC的增殖活性沒有影響（P＞ 0.05），而200 μmol/L Sal組細胞增殖活性被顯著抑制（P=0.000 8，圖1A）。與對照組相比，5、10、20 ng/mL TNF-α組細胞增殖活性無明顯變化（P＞0.05），當TNF-α濃度＞40 ng/mL時細胞增殖活性顯著下降（P＜0.000 1，圖1B）。于是選用50、100 μmol/L 的 Sal和 40 ng/mL的TNF-α 用于后續(xù)實驗。

圖1 紅景天苷及TNF-α對HCAEC增殖活性的影響Fig.1 Effect of Salidroside and TNF-α on the viability of HCAEC

2.2 紅景天苷抑制炎癥因子及黏附分子的表達 RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，40 ng/mL的TNF-α可促進HCAEC細胞炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β和黏附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達（P＜ 0.000 1），而50、100 μmol/L的Sal處理后這些炎癥因子及黏附分子的mRNA表達水平顯著下降（P＜ 0.05，圖2）。

圖2 紅景天苷對TNF-α誘導的HCAEC炎癥因子和黏附分子的影響Fig.2 Effect of Salidroside on TNF-α-induced HCAEC inflammatory factors and adherent molecules

2.3 紅景天苷對PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，TNF-α作用6 h后，HCAEC細胞中p-PI3K（P=0.004 1）、p-Akt（P=0.025 2）的蛋白表達水平降低，同時p-P65、IL-6、IL-1β的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），不同濃度紅景天苷處理后p-PI3K、p-Akt的蛋白水平顯著升高，而p-P65、IL-6、IL-1β的蛋白表達顯著下降（P＜0.05，圖3）。

圖3 紅景天苷對PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的影響Fig.3 Effect of Salidroside on PI3K/Akt and NF-κB signaling pathway-related proteins

2.4 紅景天苷改善內(nèi)皮細胞通透性 Western blot結果顯示，與對照組相比，TNF-α組ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達水平降低（P＜0.05），而紅景天苷可使ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜ 0.05，圖4）。

圖4 紅景天苷對ZO-1、VE-cadherin蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of Salidroside on expression levels of ZO-1 and VE-cadherin proteins

2.5 紅景天苷減輕氧化應激損傷 采用DCFH-DA熒光探針檢測各組細胞內(nèi)ROS含量變化情況如圖5A所示，與對照組相比，TNF-α組的熒光強度顯著增強。而紅景天苷作用之后，熒光強度顯著減弱，提示紅景天苷可減少模型組中ROS的生成。由圖5B-C所知，與對照組比較，TNF-α組細胞內(nèi)抗氧化酶SOD及GSH-Px活性均顯著下降（P＜0.05），紅景天苷可使SOD及GSH-Px的活性顯著升高（P＜0.05）。

圖5 紅景天苷對HCAEC細胞ROS水平及SOD、GSH-Px活性的影響Fig.5 Effects of Rhodiola rosea on ROS levels and SOD and GSH-Px activities in HCAECs

3 討論

盡管KD被人們認識已有50余年，但KD導致CAL的機制仍未明確，現(xiàn)有的研究［15］發(fā)現(xiàn)，CAL與血管內(nèi)皮功能障礙關系密切。本研究中用KD合并CAL時顯著升高的TNF-α刺激HCAEC作為川崎病冠脈損傷細胞模型，發(fā)現(xiàn)多種炎癥因子過度表達、內(nèi)皮細胞通透性增加，這與川崎病所致CAL病理改變一致［16］，提示成功構建了川崎病冠狀動脈損傷模型。

有研究［11］指出，具有抗炎或免疫調(diào)節(jié)作用的中藥化學物質(zhì)可作為KD的潛在治療藥物。小檗堿是中藥黃連的有效成分，已被證明可以減輕KD血清誘導的冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙［17］，而具有類似藥理活性的紅景天苷也被發(fā)現(xiàn)能在多種信號途徑中調(diào)節(jié)細胞因子釋放和蛋白表達，發(fā)揮減輕機體炎癥及保護心血管等作用，近幾年紅景天苷在許多疾病如心腦血管疾病、代謝相關等疾病中的作用及作用機制也備受關注［18］。例如，在低壓缺氧誘導的心肌損傷大鼠中，紅景天苷可激活PI3K/Akt信號通路減輕炎癥反應，改善心臟結構和功能［19］。也能抑制NF-κB途徑，促進大鼠軟骨細胞增殖，緩解骨關節(jié)炎大鼠軟骨退變［20］。在代謝性疾病中，紅景天苷可通過促進脂肪干細胞增殖分化誘導糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合［21］。推測紅景天苷可通過某些信號途徑在KD合并CAL中發(fā)揮保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路異?；罨烧T導川崎病患兒免疫功能紊亂，并參與CAL的發(fā)生［22］。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）是血管內(nèi)皮細胞之間連接的關鍵分子，其結構和功能異常會造成內(nèi)皮細胞層通透性增加，進而發(fā)生炎癥反應［23］。而緊密連接蛋白（ZO-1）在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞通透性方面起著非常重要的作用，LAI等［24］發(fā)現(xiàn)KD合并CAL患者血清中ZO-1的水平降低。在本研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導HCAEC細胞后，p-P65蛋白表達水平升高，其下游炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1、VCAM-1的基因表達水平而也顯著升高，這提示NF-κB信號通路被活化后使HCAEC細胞產(chǎn)生炎癥反應。同時也觀察到HCAEC細胞損傷后ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達量降低，以致細胞膜上連接蛋白減少，使細胞膜通透性增大促使炎癥發(fā)生。使用紅景天苷干預后，上述作用均可被逆轉(zhuǎn)，因此認為紅景天苷可通過抑制促炎因子的表達、降低細胞膜通透性進而減輕KD冠狀動脈炎癥損傷。

據(jù)報道［25］內(nèi)皮功能障礙是大多數(shù)心血管疾病發(fā)病的初始步驟，而氧化應激是這一過程的關鍵驅(qū)動因素。XU等［17］用KD血清誘導HCAEC細胞建立KD內(nèi)皮細胞損傷模型，證實了KD氧化應激的發(fā)生。同樣，在本研究中觀察到TNF-α作用于HCAEC后，p-PI3K、p-Akt的蛋白表達含量下降，PI3K/Akt信號通路被顯著抑制，同時存在ROS過量表達，GSH-px、SOD的活性下降，這意味著HCAEC細胞發(fā)生氧化應激并產(chǎn)生功能障礙，而紅景天苷可對抗這些作用。因此認為紅景天苷發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用可能是通過激活PI3K/Akt信號通路完成的。

綜上所述，紅景天苷減輕TNF-α誘導的HCAEC細胞炎癥反應和氧化應激水平使冠狀動脈內(nèi)皮細胞恢復相應功能，可能是通過激活PI3K/Akt和抑制NF-κB信號通路完成的。本研究初步探索了紅景天苷在KD冠狀動脈損傷中的抗炎及抗氧化作用及作用機制，為紅景天苷的臨床應用提供理論依據(jù)。但本研究還存在一定的局限性，目前僅涉及細胞實驗，后續(xù)本課題組還將繼續(xù)完善相關基因的敲除及過表達等實驗深入探究其機制，并在動物實驗中進一步驗證。