胡琳 楊艷娟 李潔瀅 周忠 田正 焦蓉
湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院兒科(湖北 襄陽 441000)
川崎病(Kawasaki disease,KD)是一種好發(fā)于5歲以下兒童的免疫性血管炎,若未得到及時的治療,可發(fā)生多種并發(fā)癥,其中最嚴重的是冠狀動脈損傷(coronary arterylesion,CAL),其病因及發(fā)病機制尚未明確,目前的研究提示可能與感染、血管內(nèi)皮損傷等因素有關[1-2]。
磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路參與細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導途徑,也參與炎癥及氧化應激的調(diào)控[3],郭鑫等[4]認為PI3K/Akt信號通路激活后對KD冠狀動脈內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路在KD中起著很重要的作用,該通路的激活可產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應引起細胞因子風暴,可促使炎癥因子如白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-8(IL-8)及黏附分子如血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等的產(chǎn)生,并介導中性粒細胞的聚集、浸潤,血管通透性增加,最終導致冠狀動脈損傷[5-7]。氧化應激與很多疾病的發(fā)生有關,與人體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡之中,若這種平衡關系被破壞就會產(chǎn)生氧化應激損傷,導致活性氧(ROS)過度表達及抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性下降,進一步導致血管內(nèi)皮細胞功能異常[8]。因此,減輕急性期炎癥反應、保護血管內(nèi)皮結構和功能完整或許對KD合并CAL的防治有一定的幫助。
目前KD的經(jīng)典治療方案是丙種球蛋白和阿司匹林聯(lián)合用藥,但仍有部分患者對丙種球蛋白治療無反應[9-10],因此尋找輔助治療藥物極為重要,有學者建議使用天然藥物作為川崎病的輔助治療[11]。
紅景天苷(Salidroside,Sal)是植物紅景天的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化等多種特點,可通過抑制炎癥、氧化應激等發(fā)揮保護內(nèi)皮功能的作用[12]。盡管紅景天苷有如此多的生物學作用,但在KD中紅景天苷是否可以通過PI3K/Akt和NF-κB信號通路減輕炎癥反應和氧化應激水平發(fā)揮冠狀動脈保護作用尚未見相關報道。
依據(jù)目前國內(nèi)外已建立的KD內(nèi)皮細胞模型[13-14],本研究將沿用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCAEC)這一方法來建立KD冠狀動脈損傷細胞模型,并探討紅景天苷對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCAEC)炎癥反應和氧化應激損傷的保護作用及其機制,期望為川崎病的治療提供新的思路。
1.1 實驗材料 HCAEC細胞購自于Otwo Biotech;TNF-α購自于Pepro Tech;Sal購自MCE;高糖DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco;CCK-8試劑盒購自Biosharp;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒購自Takara;ROS檢測試劑盒購自Solarbio,SOD及GSH-px分析試劑盒購自南京建成;抗p-PI3K85(Bioss);抗 p-NF-κBp65(Wanleibio);抗 p-Akt(Affinity);抗IL-6、IL-1β、ZO-1及VE-cadherin(Proteintech)。引物設計及合成由武漢金開瑞生物工程有限公司完成。本研究已經(jīng)過湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會審批(審查批號:XYYYE20210030號)
1.2 細胞培養(yǎng)與分組 在HCAEC中加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液,并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),每隔24 h進行換液,每3天傳代一次。將對數(shù)生長期的HCAEC細胞隨機分為Con組、TNF-α組、TNF-α+50 μmol/L Sal組、TNF-α+100 μmol/L Sal組。
1.3 CCK-8法檢測細胞增殖活性 將HCAEC(1×104/mL)接種在96孔板中,每孔100 μL。設置不同濃度梯度的紅景天苷(12.5、25、50、100、200 μmol/L)作用24 h,或 TNF-α(5、10、20、40、80 ng/mL)作用6 h,并設立空白對照,每組5個復孔,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,在酶標儀450 nm處測定吸光度值,計算細胞增殖率。
1.4 RT-qPCR法檢測細胞炎癥因子及黏附分子mRNA的表達情況 將HCAEC(1×106/mL)接種于6孔板中,先用40 ng/mL的TNF-α處理細胞6 h,再加或不加50 μmol/L和100 μmol/L的紅景天苷處理24 h,用Trizol試劑提取總RNA,取1 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA取2 μL為模板進行PCR。以2-ΔΔCT法進行相對定量分析。實驗中使用的引物見表1。
表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers
1.5 Western blot法檢測PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的表達情況 按照上述方法鋪板、處理細胞,采用RIPA細胞裂解液于冰浴上提取總蛋白,BCA法定量,加入loadding buffer煮沸10 min。取25 μg等量蛋白上樣,進行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳后轉(zhuǎn)入PVDF膜,用5%脫脂奶粉進行封閉1.5 h,分別加入一抗(β-actin、p-PI3K、p-Akt、p-P65、VE-cadherin、ZO-1、IL-1β、IL-6)4 ℃孵育過夜后,用TBST漂洗3次,加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h,用TBST洗滌3次,加入ECL發(fā)光顯影,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照,分析目的蛋白條帶相對分子質(zhì)量及灰度值。
1.6 DCFH-DA法觀察細胞ROS生成情況 將HCAEC細胞以2×104個/孔的密度接種于24孔板中,按照上述方法處理細胞,添加2'-7'-二氯二醋酸熒光素(DCFH-DA),在CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min,用PBS洗滌細胞3次,在熒光顯微鏡(200×)下觀察綠色熒光,采集圖像并分析各組熒光強度。
1.7 檢測細胞上清液中SOD、GSH-px的活性 將HCAEC細胞以100×104個/孔的密度接種于40 mm培養(yǎng)皿中,按照上述方法處理細胞,收集細胞上清,按照試劑盒說明書檢測各組細胞SOD、GSH-Px活性。
1.8 統(tǒng)計學方法 本文所有實驗均重復3次,采用Graphpad 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示,兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 紅景天苷及TNF-α對HCAEC增殖活性的影響 CCK-8結果顯示,與對照組相比,12.5、25、50、100 μmol/L的Sal對HCAEC的增殖活性沒有影響(P> 0.05),而200 μmol/L Sal組細胞增殖活性被顯著抑制(P=0.000 8,圖1A)。與對照組相比,5、10、20 ng/mL TNF-α組細胞增殖活性無明顯變化(P>0.05),當TNF-α濃度>40 ng/mL時細胞增殖活性顯著下降(P<0.000 1,圖1B)。于是選用50、100 μmol/L 的 Sal和 40 ng/mL的TNF-α 用于后續(xù)實驗。
圖1 紅景天苷及TNF-α對HCAEC增殖活性的影響Fig.1 Effect of Salidroside and TNF-α on the viability of HCAEC
2.2 紅景天苷抑制炎癥因子及黏附分子的表達 RT-qPCR結果顯示,與對照組相比,40 ng/mL的TNF-α可促進HCAEC細胞炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β和黏附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達(P< 0.000 1),而50、100 μmol/L的Sal處理后這些炎癥因子及黏附分子的mRNA表達水平顯著下降(P< 0.05,圖2)。
圖2 紅景天苷對TNF-α誘導的HCAEC炎癥因子和黏附分子的影響Fig.2 Effect of Salidroside on TNF-α-induced HCAEC inflammatory factors and adherent molecules
2.3 紅景天苷對PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的影響 Western blot結果顯示,與對照組相比,TNF-α作用6 h后,HCAEC細胞中p-PI3K(P=0.004 1)、p-Akt(P=0.025 2)的蛋白表達水平降低,同時p-P65、IL-6、IL-1β的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),不同濃度紅景天苷處理后p-PI3K、p-Akt的蛋白水平顯著升高,而p-P65、IL-6、IL-1β的蛋白表達顯著下降(P<0.05,圖3)。
圖3 紅景天苷對PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的影響Fig.3 Effect of Salidroside on PI3K/Akt and NF-κB signaling pathway-related proteins
2.4 紅景天苷改善內(nèi)皮細胞通透性 Western blot結果顯示,與對照組相比,TNF-α組ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達水平降低(P<0.05),而紅景天苷可使ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達水平顯著上調(diào)(P< 0.05,圖4)。
圖4 紅景天苷對ZO-1、VE-cadherin蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of Salidroside on expression levels of ZO-1 and VE-cadherin proteins
2.5 紅景天苷減輕氧化應激損傷 采用DCFH-DA熒光探針檢測各組細胞內(nèi)ROS含量變化情況如圖5A所示,與對照組相比,TNF-α組的熒光強度顯著增強。而紅景天苷作用之后,熒光強度顯著減弱,提示紅景天苷可減少模型組中ROS的生成。由圖5B-C所知,與對照組比較,TNF-α組細胞內(nèi)抗氧化酶SOD及GSH-Px活性均顯著下降(P<0.05),紅景天苷可使SOD及GSH-Px的活性顯著升高(P<0.05)。
圖5 紅景天苷對HCAEC細胞ROS水平及SOD、GSH-Px活性的影響Fig.5 Effects of Rhodiola rosea on ROS levels and SOD and GSH-Px activities in HCAECs
盡管KD被人們認識已有50余年,但KD導致CAL的機制仍未明確,現(xiàn)有的研究[15]發(fā)現(xiàn),CAL與血管內(nèi)皮功能障礙關系密切。本研究中用KD合并CAL時顯著升高的TNF-α刺激HCAEC作為川崎病冠脈損傷細胞模型,發(fā)現(xiàn)多種炎癥因子過度表達、內(nèi)皮細胞通透性增加,這與川崎病所致CAL病理改變一致[16],提示成功構建了川崎病冠狀動脈損傷模型。
有研究[11]指出,具有抗炎或免疫調(diào)節(jié)作用的中藥化學物質(zhì)可作為KD的潛在治療藥物。小檗堿是中藥黃連的有效成分,已被證明可以減輕KD血清誘導的冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙[17],而具有類似藥理活性的紅景天苷也被發(fā)現(xiàn)能在多種信號途徑中調(diào)節(jié)細胞因子釋放和蛋白表達,發(fā)揮減輕機體炎癥及保護心血管等作用,近幾年紅景天苷在許多疾病如心腦血管疾病、代謝相關等疾病中的作用及作用機制也備受關注[18]。例如,在低壓缺氧誘導的心肌損傷大鼠中,紅景天苷可激活PI3K/Akt信號通路減輕炎癥反應,改善心臟結構和功能[19]。也能抑制NF-κB途徑,促進大鼠軟骨細胞增殖,緩解骨關節(jié)炎大鼠軟骨退變[20]。在代謝性疾病中,紅景天苷可通過促進脂肪干細胞增殖分化誘導糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合[21]。推測紅景天苷可通過某些信號途徑在KD合并CAL中發(fā)揮保護作用。
研究發(fā)現(xiàn),NF-κB信號通路異?;罨烧T導川崎病患兒免疫功能紊亂,并參與CAL的發(fā)生[22]。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)是血管內(nèi)皮細胞之間連接的關鍵分子,其結構和功能異常會造成內(nèi)皮細胞層通透性增加,進而發(fā)生炎癥反應[23]。而緊密連接蛋白(ZO-1)在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞通透性方面起著非常重要的作用,LAI等[24]發(fā)現(xiàn)KD合并CAL患者血清中ZO-1的水平降低。在本研究中發(fā)現(xiàn),TNF-α誘導HCAEC細胞后,p-P65蛋白表達水平升高,其下游炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1、VCAM-1的基因表達水平而也顯著升高,這提示NF-κB信號通路被活化后使HCAEC細胞產(chǎn)生炎癥反應。同時也觀察到HCAEC細胞損傷后ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達量降低,以致細胞膜上連接蛋白減少,使細胞膜通透性增大促使炎癥發(fā)生。使用紅景天苷干預后,上述作用均可被逆轉(zhuǎn),因此認為紅景天苷可通過抑制促炎因子的表達、降低細胞膜通透性進而減輕KD冠狀動脈炎癥損傷。
據(jù)報道[25]內(nèi)皮功能障礙是大多數(shù)心血管疾病發(fā)病的初始步驟,而氧化應激是這一過程的關鍵驅(qū)動因素。XU等[17]用KD血清誘導HCAEC細胞建立KD內(nèi)皮細胞損傷模型,證實了KD氧化應激的發(fā)生。同樣,在本研究中觀察到TNF-α作用于HCAEC后,p-PI3K、p-Akt的蛋白表達含量下降,PI3K/Akt信號通路被顯著抑制,同時存在ROS過量表達,GSH-px、SOD的活性下降,這意味著HCAEC細胞發(fā)生氧化應激并產(chǎn)生功能障礙,而紅景天苷可對抗這些作用。因此認為紅景天苷發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用可能是通過激活PI3K/Akt信號通路完成的。
綜上所述,紅景天苷減輕TNF-α誘導的HCAEC細胞炎癥反應和氧化應激水平使冠狀動脈內(nèi)皮細胞恢復相應功能,可能是通過激活PI3K/Akt和抑制NF-κB信號通路完成的。本研究初步探索了紅景天苷在KD冠狀動脈損傷中的抗炎及抗氧化作用及作用機制,為紅景天苷的臨床應用提供理論依據(jù)。但本研究還存在一定的局限性,目前僅涉及細胞實驗,后續(xù)本課題組還將繼續(xù)完善相關基因的敲除及過表達等實驗深入探究其機制,并在動物實驗中進一步驗證。