陳惠娟 劉小燕 劉 霖 肖媛媛 胡芷晴 張 浩 徐志紅

四川省德陽市人民醫(yī)院(618000)

染色體異?？梢鸹虻娜笔?、重復(fù)、重排，導(dǎo)致自發(fā)流產(chǎn)、胚胎畸形、出生缺陷[1]。染色體異常疾病目前尚無有效治療方法，對(duì)高危孕婦產(chǎn)前診斷，對(duì)胎兒染色體異常者進(jìn)行合理干預(yù)，是減少降低出生缺陷有效方法[2]。本文分析羊水細(xì)胞異常染色體核型的分布及不同產(chǎn)前診斷指征胎兒染色體異常檢出情況，為臨床有效干預(yù)提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

回顧性收集2018年1月-2020年6月來本院遺傳咨詢門診就診并行羊膜腔穿刺術(shù)產(chǎn)前診斷的3245例孕婦臨床資料。產(chǎn)前診斷指征包括唐氏篩查高/臨界風(fēng)險(xiǎn)、高齡、胎兒頸部透明帶厚度(NT)值異常、B超發(fā)現(xiàn)多發(fā)畸形、不良妊娠史、無創(chuàng)產(chǎn)前DNA篩查(NIPT)染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)、夫妻一方染色體異常、孕期用藥及致畸因子接觸史、夫妻一方先天異常、家族單基因疾病攜帶、要求診斷。年齡18～49歲，孕16～32周。所有孕婦術(shù)前簽署知情同意書。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 染色體檢測(cè)方法

B超引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20ml分別裝于2管15ml無菌離心管中，轉(zhuǎn)移至產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室離心。在超凈工作臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格無菌操作棄上清液，留取0.5ml制備為細(xì)胞懸液，分別接種于裝有3.5ml羊水培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。置5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)7天。將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并換液。隨后繼續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，如培養(yǎng)瓶底可觀察到較多較大克隆的貼壁細(xì)胞，并有較多圓而亮的細(xì)胞，便可收獲細(xì)胞。將培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞常規(guī)制片、G顯帶。顯微鏡下計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，選擇5個(gè)分散較好帶紋清晰的5個(gè)細(xì)胞分裂相進(jìn)行核型分析，觀察到異常核型加大中期分裂相計(jì)數(shù)和羊水細(xì)胞染色體的核型分析。羊水細(xì)胞染色體核型描述和命名依據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制。選擇同時(shí)進(jìn)行基于二代測(cè)序技術(shù)的染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)(CNV-seq)孕婦，B超引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)時(shí)，另取5ml羊水于離心管中，無菌轉(zhuǎn)移至產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室離心棄上清，根據(jù)TIANamp基因組DNA提取試劑盒(天根)說明書提取羊水細(xì)胞基因組DNA。根據(jù)NextSeq 550AR(安諾優(yōu)達(dá))試劑盒說明書進(jìn)行文庫構(gòu)建、質(zhì)量控制、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果根據(jù)ACMG指南進(jìn)行CNV評(píng)級(jí)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用(%)表示計(jì)數(shù)資料，χ2檢驗(yàn)。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羊水細(xì)胞染色體異常核型分布

本研究分析的3245例羊水細(xì)胞樣本，培養(yǎng)成功3244例，成功率99.97%；發(fā)現(xiàn)異常核型151例，異常檢出率4.56%。異常核型分布見表1。

表1 151例羊水細(xì)胞染色體異常核型檢出情況

2.2 染色體異常核型在不同產(chǎn)前診斷指征中檢出情況

3244例羊水標(biāo)本中染色體異常核型檢出151例。不同產(chǎn)前診斷指征者異常檢出率不同，其中NIPT染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)檢出率最高，其次為夫妻一方染色體異常，再次為NT值異常。在不同產(chǎn)前指征中以血清學(xué)唐氏篩查高/臨界風(fēng)險(xiǎn)、高齡妊娠、B超多發(fā)畸形3個(gè)指征為主。各產(chǎn)前指征染色體異常檢出率具有差異(P<0.05)，檢出情況見表2。其中因夫妻雙方攜帶同型地中海貧血基因行產(chǎn)前診斷的23例孕婦，19例為夫妻雙方攜帶α地中海貧血基因，4例夫妻雙方攜帶β地中海貧血基因。經(jīng)產(chǎn)前診斷3例為α地中海貧血基因純合突變，1例為β地中?；蚣兒贤蛔儯⒔K止妊娠。見表3。

表2 羊水染色體核型高危因素與異常核型分析[例(%)]

表3 不同產(chǎn)前診斷指證者核型正常胎兒妊娠結(jié)局[例(%)]

2.3 產(chǎn)前篩查NIPT與血清學(xué)檢測(cè)效率

本文NIPT染色體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦55例，經(jīng)產(chǎn)前診斷分析后發(fā)現(xiàn)NIPT對(duì)T21具有較高的準(zhǔn)確率，對(duì)T18、T13準(zhǔn)確率較差，對(duì)性染色體數(shù)目異常準(zhǔn)確率最低。見表4。

表4 NIPT染色體異常與羊水診斷結(jié)果[例(%)]

2.4 CNV-seq 在不同產(chǎn)前診斷指征中檢出情況

1089例行CNV-seq檢測(cè)，染色體非整倍體檢出37例，嵌合體檢出5例，致病性CNV異常檢出16例。B超檢查異常及NIPT染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)指征者染色體拷貝數(shù)變異(CNV)異常檢測(cè)率最高。見表5。

表5 不同產(chǎn)前診斷指證者CNV-seq檢測(cè)結(jié)果[例(%)]

2.5 妊娠結(jié)局

3244例中有2948例明確妊娠結(jié)局，隨訪率90.9%(2948/3244)，151例羊水細(xì)胞染色體異常核型中2例無明確妊娠結(jié)局。終止妊娠65例，活產(chǎn)83例。3093例羊水細(xì)胞染色體核型正常中有明確妊娠結(jié)局2799例，活產(chǎn)2778例，活產(chǎn)率為99.3%。21例因B超發(fā)現(xiàn)異常終止妊娠，14例經(jīng)CNV-seq檢測(cè)找到遺傳學(xué)病因。見表3、表6。

表6 核型異常胎兒妊娠結(jié)局[例(%)]

3 討論

3.1 產(chǎn)前診斷是檢出染色體異常有效方法

染色體數(shù)目異常與結(jié)構(gòu)異?？梢鹑旧w疾病，有效檢出染色體異常核型方法至關(guān)重要。多種篩查和診斷方法聯(lián)合應(yīng)用可相互補(bǔ)充提高診斷效率。對(duì)高危因素指征孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，能有效檢出異常染色體避免出生缺陷發(fā)生。本文分析回顧了3245例羊水標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果，培養(yǎng)失敗1例，成功核型分析3244例，包括染色體多態(tài)共檢出異常核型151例，異常檢出率為4.65%。常染色體數(shù)目異常主要以21三體核型為主，包括27例標(biāo)準(zhǔn)型、2例嵌合型，該疾病是最常見的染色體疾病，是產(chǎn)前診斷重要的目標(biāo)疾病。其次為18三體核型，4例標(biāo)準(zhǔn)型、2例嵌合型，其發(fā)生率僅次于21三體綜合征，是圍產(chǎn)嬰兒死亡的重要疾病之一。性染色體數(shù)目異常主要以克氏綜合征最為多見，其次為特納綜合征嵌合體?？耸暇C合征在新生兒男嬰中的發(fā)病率為1/660[3]。

3.2 NIPT高危指征中染色體異常檢出率最高

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)是產(chǎn)前篩查的一種方法，檢測(cè)基于孕期母體外周血胎兒游離DNA與母體游離DNA共同檢測(cè)以判斷胎兒非整倍體異常。相對(duì)于傳統(tǒng)血清學(xué)產(chǎn)前篩查，具有更高的檢出率、更低的假陽性率及假陰性率，因此越來越被臨床醫(yī)生及孕婦所接受[4]。本文中55例孕婦因NIPT檢測(cè)為染色體異常高危人群行羊水染色體核型分析，其中21例NIPT提示有小于5Mb拷貝數(shù)變異，經(jīng)CNV-seq檢測(cè)出19例拷貝數(shù)變異，與NIPT篩查結(jié)構(gòu)相符；另外1例羊水核型分析和CNV-seq檢出缺失異常。NIPT對(duì)21三體綜合征篩查效率最高，而對(duì)于性染色體異常篩查效率表現(xiàn)較差。有研究觀察NIPT檢測(cè)胎兒性染色體異常準(zhǔn)確性發(fā)現(xiàn)，其對(duì)性染色陽性預(yù)測(cè)值較低，對(duì)性染色體嵌合者檢出能力更為不理想[5]。

NIPT基本原理是基于母體外周血游離胎兒DNA來源于滋養(yǎng)層細(xì)胞，占游離DNA的15%～20%。因此當(dāng)任何一方面出現(xiàn)異常都將導(dǎo)致不準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果，如假陽性及假陰性。導(dǎo)致假陽性的常見也是主要原因是限制性胎盤嵌合，胎盤限制性三體嵌合其凋亡細(xì)胞DNA釋放到母體循環(huán)系統(tǒng)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。其次為母體存在自身嵌合現(xiàn)象、母體在目標(biāo)染色體上存在拷貝數(shù)增加、母體罹患惡性腫瘤或雙胎之一停止發(fā)育的胎兒將異常染色體DNA釋放入母體循環(huán)均可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的常見原因?yàn)槟阁w循環(huán)中胎兒游離DNA濃度較低。當(dāng)母體體重過大，母體循環(huán)血容量增加及大量脂肪細(xì)胞凋亡后其DNA釋放入血導(dǎo)致胎兒游離DNA相對(duì)稀釋；其次母體循環(huán)胎兒游離DNA含量隨孕周增加而增加，因此孕周過小，胎兒游離DNA含量低于4%時(shí)會(huì)導(dǎo)致NIPT技術(shù)檢測(cè)不出胎兒游離DNA而使結(jié)果出現(xiàn)假陰性；再次導(dǎo)致母體大量游離DNA釋放入血的疾病如血栓栓塞、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、維生素B12缺乏等均會(huì)使胎兒游離DNA濃度相對(duì)降低導(dǎo)致假陰性結(jié)果。在罕見情況下胎兒嵌合體與胎盤染色體不一致時(shí)也是導(dǎo)致假陰性結(jié)果的另一原因[4]。鑒于此，相對(duì)于母血清產(chǎn)前篩查即使NIPT對(duì)21三體綜合、18三體綜合征、13三體綜合征具有更高的檢出率和準(zhǔn)確性，也不能僅僅依據(jù)其陽性結(jié)果做出診斷，需要行侵入性產(chǎn)前診斷以明確診斷。

我國2015年“高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查技術(shù)試行規(guī)范”規(guī)定NIPT技術(shù)的目標(biāo)疾病仍是21三體綜合、18三體綜合征、13三體綜合征。盡管隨著技術(shù)的不斷發(fā)展對(duì)胎兒游離DNA性全基因組測(cè)序也能發(fā)現(xiàn)部分其他染色體非整倍體或結(jié)構(gòu)異常，但一方面增加檢測(cè)成本，另一方其準(zhǔn)確性需進(jìn)一步循證醫(yī)學(xué)證實(shí)。因此NIPT技術(shù)不能完全滿足產(chǎn)前篩查目的。國際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)推薦的一線產(chǎn)前篩查方案為妊娠早期(11～13周+6)超聲檢查并測(cè)量NT結(jié)合母體血清絨毛膜促性腺激素、妊娠相關(guān)糖蛋白A水平檢測(cè)，妊娠中期行胎兒結(jié)構(gòu)超聲篩查。確定一線篩查方案某一風(fēng)險(xiǎn)孕婦人群使用NIPT檢測(cè)技術(shù)作為二線篩查的策略得到推薦[6]。同時(shí)妊娠中期結(jié)構(gòu)超聲篩查在胎兒重大結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)中起重要作用。

3.3 NT在產(chǎn)前診斷中的價(jià)值

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷提高，超聲在檢測(cè)胎兒異常中應(yīng)用越來越廣泛。其中NT這一胎兒結(jié)構(gòu)成為妊娠早期胎兒染色體異常檢測(cè)的超聲指標(biāo)。研究表明NT增厚不僅與胎兒染色體異常有關(guān)，同時(shí)還與遺傳性綜合征、結(jié)構(gòu)異常、心臟發(fā)育異常等有關(guān)[7]。目前NT值作為妊娠早期胎兒非整倍體染色體異常的超聲指標(biāo)具有高的靈敏性和特異性[8]。在本文分析中NT值異常指征的胎兒染色體異常檢出率為13.8%，僅次于NIPT高風(fēng)險(xiǎn)與夫婦一方染色體異常的指征，對(duì)篩查胎兒染色體異常有重要臨床意義。

3.4 夫婦一方染色體異常及高齡孕婦更應(yīng)重視產(chǎn)前診斷

隨著我國人口政策調(diào)整，高齡孕婦增加，成為出生缺陷防控的重要對(duì)象。本文高齡孕婦染色體異常檢出率為4.3%。隨著母體年齡增長(zhǎng)生成畸形配子的概率增加，易發(fā)生染色體不分離導(dǎo)致胎兒染色體“三體”疾病，如21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征[9]。因此我國法律規(guī)定，針對(duì)高齡孕婦直接通過羊膜腔穿刺術(shù)取得胎兒羊水細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷，避免因目前母血清產(chǎn)前篩查技術(shù)的局限性引起的漏篩、漏檢、漏診情況。高齡孕婦更應(yīng)重視產(chǎn)前診斷，預(yù)防染色體異?；純撼錾Ｔ诋a(chǎn)前診斷指征中夫婦雙方染色體異常者胎兒染色體異常檢出率為25%，僅次于NIPT高危組。父母染色體出現(xiàn)平衡性改變時(shí)，其遺傳物質(zhì)劑量沒有改變而不出現(xiàn)臨床表型。但在生育過程中可能會(huì)形成不平衡性配子，胎兒將會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重臨床表現(xiàn)，甚至不能正常發(fā)育至分娩。因此夫婦雙方有染色體異常者是產(chǎn)前診斷高危指征之一，應(yīng)當(dāng)予以高度重視。

3.5 羊水細(xì)胞染色體核型分析可聯(lián)合分子遺傳檢測(cè)方法

染色體G顯帶核型分析是經(jīng)典的遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是診斷染色體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷及輔助生殖等領(lǐng)域[10]。但細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)情況、檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)、有限的分辨率等因素限制了其對(duì)染色體疾病，尤其是染色體小片段缺失/重復(fù)異常的檢出。本文2799例核型正常并有明確妊娠結(jié)局中，21例因后續(xù)發(fā)現(xiàn)B超異常終止妊娠，其中14例通過CNV-seq 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)變異，找到遺傳學(xué)病因。CNV-seq技術(shù)對(duì)CNV異常檢測(cè)效力是染色體核型分析所不能達(dá)到的，因此在產(chǎn)前診斷中僅僅應(yīng)用單純的核型分析方法或僅使用一種檢測(cè)技術(shù)均不能滿足臨床需求。核型分析聯(lián)合CNV-seq檢測(cè)可提高對(duì)染色體異常檢出率[11]。但應(yīng)注意平衡易位或倒位這類不涉及遺傳物質(zhì)丟失的改變，CNV-seq技術(shù)不能有效檢出。目前各類檢測(cè)技術(shù)在產(chǎn)前診斷應(yīng)用過程中，逐漸形成聯(lián)合應(yīng)用模式，集各檢測(cè)技術(shù)之優(yōu)勢(shì)相互補(bǔ)充其局限性。如核型分析聯(lián)合CNV-Seq、核型分析聯(lián)合染色體微陣列分析[12]，基于檢測(cè)STR的QF-PCR聯(lián)合CNV-seq、核型聯(lián)合產(chǎn)前BoBs以到達(dá)到快速檢測(cè)集9種核型不能檢出的常見微缺失/重復(fù)綜合征等等[13-14]。

NIPT高風(fēng)險(xiǎn)、母血清唐氏篩查高危是產(chǎn)前診斷指征。高齡、夫妻雙方染色體異常、B超異常等指征仍應(yīng)予以重視。經(jīng)典的核型分析聯(lián)合檢測(cè)拷貝數(shù)變異的CNV-seq可提高染色體異常檢出。針對(duì)各類產(chǎn)前診斷指征的染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦行羊膜腔穿刺術(shù)，對(duì)胎兒染色體進(jìn)行檢查，可有效檢出染色體異常胎兒，為遺傳咨詢及臨床干預(yù)提高依據(jù)。