湯麗華， 張亮亮, 張 禾

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；林木生物質(zhì)低碳高效利用國(guó)家工程研究中心；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042)

單寧在制藥、生化、日化、食品以及精細(xì)化工等高科技領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，市場(chǎng)上供不應(yīng)求[1-3]。目前市場(chǎng)上的單寧產(chǎn)品主要有五倍子單寧、塔拉單寧、栗木單寧等[4-5]。我國(guó)是五倍子單寧主要生產(chǎn)國(guó)，五倍子對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境有一定的條件要求，主要種植于我國(guó)的西南方[6]。塔拉單寧與五倍子單寧同屬于沒(méi)食子單寧，主要存在于塔拉果莢中，塔拉粉含單寧50%左右[7-8]。目前，我國(guó)每年可供加工利用的五倍子原料在9 000噸左右，而從秘魯?shù)饶厦绹?guó)家進(jìn)口的塔拉粉產(chǎn)品超過(guò)2萬(wàn)噸/年，塔拉粉已超過(guò)五倍子成為植物單寧加工的主要原料。塔拉樹(shù)生命力頑強(qiáng)，對(duì)生長(zhǎng)條件要求沒(méi)有五倍子高，種植范圍廣，產(chǎn)量大，塔拉單寧與五倍子單寧有相似的結(jié)構(gòu)，工業(yè)上可被用來(lái)替代五倍子作為生產(chǎn)沒(méi)食子酸、單寧酸等產(chǎn)品的原料[9-11]。

單寧酸檢測(cè)方法很多，有皮粉法、紫外分光光度法、高效液相法、氣相色譜法等[12]。而不同的檢測(cè)方法對(duì)不同的單寧酸產(chǎn)品的靈敏度和穩(wěn)定性存在一定的差異性。高效液相法與氣相色譜法雖可檢測(cè)單寧酸，但至今沒(méi)有完善的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定不同單寧酸產(chǎn)品時(shí)，需要對(duì)流動(dòng)相、配比、流速、柱溫等條件進(jìn)行相應(yīng)的選擇。紫外法(LY/T 1642—2005，GB/T 27985—2011)與皮粉法(LY/T 1082—2008)雖有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但主要適用于五倍子單寧。由于目前塔拉單寧分析沒(méi)有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)企業(yè)采用紫外法對(duì)塔拉單寧含量進(jìn)行測(cè)定，但由于塔拉單寧與五倍子單寧在化學(xué)結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，利用紫外法測(cè)定塔拉單寧含量所得數(shù)值普遍偏低；而皮粉法測(cè)定操作耗時(shí)比較長(zhǎng)，步驟非常繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高[13-15]。因此，本研究對(duì)5種不同含量的塔拉單寧分別用紫外法與皮粉法進(jìn)行單寧含量測(cè)定，并進(jìn)行對(duì)比研究，獲得紫外法測(cè)定塔拉單寧含量計(jì)算公式中的矯正常數(shù)，以期為制定紫外法測(cè)定塔拉單寧分析試驗(yàn)方法提供依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料試劑與儀器

塔拉單寧樣品：本實(shí)驗(yàn)室自行制備高純度塔拉單寧樣品記為T1；五峰赤誠(chéng)生物科技股份有限公司提供樣品記為T2、T3；張家界久瑞生物科技有限公司提供樣品記為T4；四川亭江新材料股份有限公司提供樣品記為T5。五倍子單寧酸標(biāo)樣(純度≥99%)、鉻皮粉(吸收單寧能力≥0.060 g/g)，均由實(shí)驗(yàn)室自行制備，所用水為一級(jí)水，其余試劑均為市售分析純。

UV/VIS Agilent Technologies carry 8454型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫公司；LC-20A液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 塔拉單寧含量測(cè)定

1.2.1紫外法 依據(jù)《單寧酸分析試驗(yàn)方法》(LY/T 1642—2005)[16]進(jìn)行紫外法分析試樣中單寧含量，實(shí)驗(yàn)中做平行樣，誤差≤0.7%，取平均值。單寧酸(X1)計(jì)算公式如下：

(1)

式中：X1—紫外法測(cè)塔拉單寧中單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%;A0—塔拉單寧樣品溶液的吸光度；A1—單寧酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的吸光度；A2—經(jīng)鉻皮粉吸附后塔拉單寧溶液的吸光度；m1—單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量，g；m0—塔拉單寧質(zhì)量，g。

1.2.2皮粉法 依據(jù)《栲膠分析試驗(yàn)方法》(LY/T 1082—2008)[17]進(jìn)行皮粉法分析試樣中單寧含量，實(shí)驗(yàn)中做平行樣，當(dāng)單寧的量≥33%，且重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差≤1.0%，取平均值。單寧酸(X2)計(jì)算公式如下：

(2)

式中： 20—定容體積與取樣體積的比值；X2—皮粉法測(cè)塔拉單寧中單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； 1.2—稀釋液與原液的體積比值；m2—可溶物質(zhì)量，g；m3—50 mL可溶物中非單寧質(zhì)量，g；m4—鉻皮粉空白殘?jiān)|(zhì)量，g；m0—塔拉單寧的質(zhì)量，g；w0—塔拉單寧含水量，%； 0.075—鉻皮粉空白試驗(yàn)的容許修正值，g/L。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.1紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析 分別將塔拉單寧T1與五倍子單寧溶解于甲醇中，均配成質(zhì)量濃度為1 g/L 的甲醇溶液。選擇T1是因?yàn)樗兌雀?，更為?zhǔn)確。利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～450 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.2HPLC分析 色譜條件：色譜柱ODS C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動(dòng)相為A-B混合液，其中，A為甲醇(含0.1%三氟乙酸)，B為水(含0.1%三氟乙酸)。梯度洗脫：0～3 min, 10%A，90%B；3～25 min, 10%～30%A,90%～70%B；25～50 min, 30%～80%A,70%～20%B；50～55 min, 80%～10%A,20%～90%B；55～60 min, 10%A,90%B。流速：1.0 mL/min；測(cè)試液質(zhì)量濃度：1 g/L(溶于甲醇)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；色譜柱溫度：28～32 ℃；進(jìn)樣量：5～15 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析通過(guò)SPSS軟件完成，利用One-way ANOVA方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外法和皮粉法測(cè)定塔拉單寧含量對(duì)比分析

紫外法和皮粉法測(cè)定5種塔拉單寧含量的對(duì)比分析見(jiàn)表1。從表1可知，利用One-way ANOVA方法對(duì)單寧含量結(jié)果數(shù)值的顯著性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：高純度的塔拉單寧(93%)用紫外法和皮粉法檢測(cè)結(jié)果并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而純度60%左右的塔拉單寧在兩種方法中存在顯著性差異(P<0.05)，出現(xiàn)這兩種不同的現(xiàn)象可能是因?yàn)楹?0%的塔拉單寧不僅含有單寧，還含有其它多糖等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)也可以與蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，加大了絡(luò)合前后的質(zhì)量差，而皮粉法主要就是利用重量法進(jìn)行測(cè)定，故導(dǎo)致皮粉法測(cè)量值偏高。提純后的塔拉單寧因含多糖等雜質(zhì)的量較低，所以高純度的塔拉單寧用皮粉法和用紫外法所測(cè)得的數(shù)值偏差不大。若不考慮多糖的影響，2種方法得到的結(jié)果以皮粉法為準(zhǔn)。

表1 紫外法和皮粉法測(cè)定5種塔拉單寧1)

由于塔拉單寧T2～T5在皮粉法和紫外法中存在顯著性差異，故對(duì)這4種塔拉單寧在2種測(cè)量方法下的數(shù)值進(jìn)行對(duì)比分析，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件SPSS計(jì)算可得皮粉法測(cè)定數(shù)值是紫外法測(cè)定數(shù)值的1.03倍，得出皮粉法和紫外法測(cè)定4種樣品的平均值分別為62.213%±2.519%、 60.475%±2.691%，故而計(jì)算出紫外法測(cè)定塔拉單寧含量計(jì)算公式中的矯正常數(shù)p為1.03。即得到利用紫外法測(cè)定塔拉單寧含量矯正計(jì)算公式(式(3))：

(3)

式中：w1—試樣干燥損失的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； 1.03—矯正常數(shù)。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.2.1紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析 分別用甲醇配制1 g/L的T1塔拉單寧與五倍子單寧溶液，進(jìn)行紫外光檢測(cè)。塔拉單寧與五倍子單寧的紫外-可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖1。從圖可以看出，在紫外-可見(jiàn)吸收光譜中塔拉單寧T1與五倍子單寧的最大吸收峰均為276 nm，這是由于塔拉單寧與五倍子單寧結(jié)構(gòu)上存在類似的多酚結(jié)構(gòu)，在276 nm處具有特定的紫外吸收。這也是紫外法測(cè)定塔拉單寧含量將紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)設(shè)置在276 nm處的原因。此外，由圖1可知，同濃度下的塔拉單寧在276 nm處的吸收峰比五倍子單寧的吸收峰要高，該位置的吸收峰主要受苯環(huán)影響，HPLC譜圖(圖2)中可明顯看到五倍子單寧主體出峰位置靠后，這說(shuō)明五倍子單寧的平均分子質(zhì)量要比塔拉單寧的平均分子質(zhì)量大，也就是說(shuō)相同質(zhì)量濃度下所含的塔拉單寧的分子個(gè)數(shù)要比五倍子單寧的分子個(gè)數(shù)多。因此，在相同質(zhì)量濃度時(shí)塔拉單寧所含的苯環(huán)的數(shù)量更多，塔拉單寧的吸光度比五倍子單寧的吸光度要高。

圖1 單寧的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.1 The UV-Vis absorption spectra of tannin

2.2.2HPLC分析 5種塔拉單寧與五倍子單寧的HPLC譜圖見(jiàn)圖2。從圖2可知，在1.3.2節(jié)色譜條件下，塔拉單寧成分出峰時(shí)間主要在20～40 min，而五倍子單寧成分出峰時(shí)間主要在30～45 min。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是塔拉單寧與五倍子單寧在化學(xué)結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，塔拉單寧分子主要是由奎寧酸通過(guò)酯鍵連接沒(méi)食子酸構(gòu)成，而五倍子單寧分子則是由葡萄糖通過(guò)酯鍵連接沒(méi)食子酸構(gòu)成[18]。

塔拉單寧tara tannin: a.T1; b.T2; c.T3; d.T4; e.T5; f.五倍子單寧Chinese gallnut tannin

3 結(jié) 論

3.1采用紫外法和皮粉法對(duì)5種塔拉單寧進(jìn)行對(duì)比分析，并用One-way ANOVA方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明：高純度的塔拉單寧(93%)在2種測(cè)試方法中無(wú)顯著差異(P>0.05)，而純度60%左右的4種塔拉單寧在2種測(cè)試方法間存在顯著性差異(P<0.05)，塔拉單寧的測(cè)定結(jié)果以皮粉法為準(zhǔn)，通過(guò)SPSS軟件可計(jì)算出紫外法測(cè)定塔拉單寧含量計(jì)算公式中的矯正常數(shù)p為1.03。

3.2紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析表明：塔拉單寧和五倍子單寧的最大吸收峰均為276 nm，同質(zhì)量濃度下塔拉單寧的吸收峰強(qiáng)度高于五倍子單寧。HPLC分析表明：塔拉單寧成分出峰時(shí)間主要在20～40 min，而五倍子單寧成分出峰時(shí)間主要在30～45 min。