肖 瀟 劉艷霞 危一飛 邢 玉 滕秀香

(1 北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，北京，100078； 2 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院婦科，北京，100010； 3 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院婦科，北京，100078； 4 中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院骨科，北京，100102)

卵巢儲備功能減退是指卵巢內卵母細胞數量減少和(或)質量下降，其臨床表現為月經稀發(fā)或頻發(fā)，以及閉經，甚至卵巢早衰導致生育能力喪失[1-2]。卵巢儲備功能下降可導致卵泡發(fā)育異常[3]。研究發(fā)現卵巢顆粒細胞參與調節(jié)卵泡的發(fā)育和生長，對卵泡發(fā)育至關重要，顆粒細胞凋亡增加是導致卵泡發(fā)育異常及卵巢功能降低的關鍵因素之一[4-6]。已有大量研究證實雷公藤的生殖毒性可引起卵巢功能減退[7-8]。近年來中藥治療卵巢功能減退的臨床療效被大量報道，中藥單體及復方抑制雷公藤多苷所誘導的卵巢顆粒細胞凋亡，改善卵巢儲備功能的實驗研究亦被學者驗證[9-14]。益腎疏肝湯被證實對卵巢儲備功能減退以及卵巢早衰等具有顯著的臨床效果[15-17]。但其作用機制仍不清楚，本研究將通過體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細胞，探究益腎疏肝湯對雷公藤多苷誘導的卵巢顆粒細胞凋亡的影響，并深入探究其可能的作用機制，以期為臨床上治療卵巢功能減退相關疾病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 取26只雌性健康的SD大鼠，日齡22～25 d，體質量50～66 g，購自于斯貝福(北京)生物技術有限公司；生產許可證：SCXK(京)2019-0010。所有大鼠均飼養(yǎng)在動物房中，適應性飼養(yǎng)1周后進行后續(xù)實驗。本實驗涉及的動物實驗已由北京隆安實驗動物中心動物倫理委員會審查批準(倫理審批號：BJlongan-L-L-0007)。

1.1.2 藥物 益腎疏肝湯是由女貞子15 g、熟地黃10 g、墨旱蓮15 g、北沙參20 g、石斛10 g、川續(xù)斷15 g、桑寄生15 g、菟絲子15 g、酒白芍10 g、月季花6 g、柴胡5 g、白梅花10 g、丹參10 g、桃仁10 g、瞿麥6 g、葛根6 g、甘草6 g組成，由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院提供，最終大鼠用藥生藥粉劑量為16.38 g/kg/d。戊酸雌二醇(上海源葉生物科技有限公司，貨號：S52227-1 g)，雷公藤多苷片(上海復旦復華藥業(yè)有限公司，國藥準字Z31020415)。

1.1.3 試劑與儀器 水合氯醛(上海易恩化學技術有限公司，貨號：R008072-500 g)，孕馬血清促性腺激素(PMSG)(北京索萊寶科技有限公司，貨號：P9970)，Hank′s溶液(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SNM237)，DMEM/F12培養(yǎng)基(廣州億寧生物技術有限公司，貨號：10-092-CV)，胎牛血清(北京杰輝博高生物技術有限公司，貨號：A15-101)，細胞計數法(CCK-8)試劑盒(上海愛必信生物科技有限公司，貨號：abs50003)，TUNEL試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司，貨號：ZY81026)，裂解胱天蛋白酶-3(cl-caspase-3)(Abcam公司，英國，貨號：ab4051)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)抗體(Abcam公司，英國，貨號：ab32028)，磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)(Abcam公司，英國，貨號：ab40776)，B細胞淋巴瘤-2(B Cell Lymphoma 2,Bcl-2)/白血病-2抗體[Santa Cruz(SCBT)公司，美國，貨號：Sc-492]；Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體(PROTEINTECH GROUP，美國，貨號：50599-2-IG)，AKT抗體(CST公司，美國，貨號：9272s)，內參GAPDH抗體(杭州賢至生物科技有限公司，貨號：AB-P-R 001)，SpectraMax iD3多功能酶標儀(中國上海美谷分子儀器有限公司，型號：SpectraMax iD3)，LW200ET-A生物顯微鏡(中國上海尖端光電科技有限公司，型號：LW200ET-A)。

1.2 方法

1.2.1 分組與含藥血清制備

1.2.1.1 大鼠卵巢顆粒細胞的制備 取6只雌性健康的SD大鼠，在適應性飼養(yǎng)1周后，每只大鼠腹腔注射50 IU的馬絨毛膜促性腺激素(曾稱孕馬血清促性腺激素)，注射48 h后，腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉，然后將大鼠脫頸處死，然后剖腹在無菌條件下取出雙側卵巢，使用預冷的Hank′s溶液將卵巢周圍脂肪和包膜等清洗干凈，然后將卵巢移入無血清的培養(yǎng)基中，然后刺破卵巢，并使顆粒細胞充分釋放出來，然后加入2.5%的胰酶(0.3 mL)反復吹打使得顆粒細胞團塊離散，然后在37 ℃條件下使用胰蛋白酶消化10 min，之后加入含有10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，靜置10 min后進行離心10 min(1 000 r/min，離心半徑10 cm)，棄上清液。加入0.2 mL 10%的胎牛血清制備懸液，并接種于96孔板中(接種密度為5×105/孔)，并在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞融合至80%～85%時進行后續(xù)實驗。

1.2.1.2 含藥血清的制備 取20只雌性健康的SD大鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，將大鼠分為3組：雷公藤含藥血清組(n=8)、益腎疏肝湯含藥血清組(n=8)和雌二醇含藥血清組(n=4)；雷公藤含藥血清組給予雷公藤多苷灌胃80 mg/(kg·d)[18]，益腎疏肝湯含藥血清組給予益腎疏肝湯灌胃16.38 g/(kg·d)，雌二醇含藥血清組給予戊酸雌二醇灌胃0.009 mg/(kg·d)，灌胃1次/d，連續(xù)7 d，在第7天灌胃2 h后，心臟采血并分離血清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 細胞分組 將細胞分為正常組(正常培養(yǎng)的細胞)、損傷組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽性對照組。正常組加入60%空白血清100 μL，損傷組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽性對照組先加入含60%雷公藤多苷含藥血清各100 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸取上清液，于中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組中分別加入20%、40%、60%的益腎疏肝湯含藥血清100 μL處理細胞，陽性對照組使用100 μL的雌二醇含藥血清處理細胞培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)細胞用于各項指標的檢測。

1.2.2 干預方法 將細胞接種于96孔板，細胞貼壁后，棄除培養(yǎng)液，分別加入等量的0、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%的益腎疏肝湯含藥血清，并添加無血清培養(yǎng)基直至100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后采用CCK-8法檢測細胞存活率；同樣方法將細胞接種于96孔板，細胞貼壁后，棄除培養(yǎng)液，使用不同濃度(0、20%、40%、60%、80%、100%)的雷公藤多苷含藥血清處理細胞48 h后，使用CCK-8法檢測細胞存活率。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 CCK-8法檢測細胞增殖 將細胞接種于96孔板中(接種密度為5×105/孔)，待細胞貼壁后按照1.2.2中的處理方法將不同濃度的益腎疏肝湯含藥血清和雷公藤多苷血清處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入100 μL的CCK-8試劑，并在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在波長為450 nm處使用酶標儀檢測吸光值(OD值)，并計算細胞存活率。并將接種于96孔板后的細胞按照1.2.2中的藥物處理分為5組：正常組、損傷組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽性對照組，藥物處理后，分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時，每孔加入100 μL的CCK-8試劑，并在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在波長為450 nm處使用酶標儀檢測OD值。

1.2.3.2 TUNEL法檢測各組細胞凋亡 采用一步脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP-生物素缺口末端標記(TUNEL)檢測卵巢顆粒細胞凋亡。將卵巢顆粒細胞以1×104/孔的密度接種于48孔板上，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照前面所述方法分組處理后，使用4%的多聚甲醛固定細胞，0.3%的Triton X-100滲透細胞。然后按照制試劑盒操作流程，使用TUNEL反應緩沖液在37 ℃遮光孵育60 min。使用熒光顯微鏡觀察凋亡細胞。

1.2.3.3 蛋白印跡法檢測各組細胞相關蛋白表達 收集各組細胞，使用放射免疫沉淀法裂解液裂解細胞后，提取各組細胞的總蛋白，使用BCA法對蛋白進行定量，然后取50 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞，結束后轉至NC膜，并浸泡在5%的脫脂奶粉中進行室溫封閉2 h，結束后加入稀釋的一抗試劑(稀釋濃度均為1∶1 000)，在4 ℃冰箱里結合過夜，第2天加入二抗試劑(稀釋濃度：1∶4 000)，室溫條件下結合2 h后滴加ECL發(fā)光顯色液，曝光并進行灰度值分析。

2 結果

2.1 不同濃度的益腎疏肝湯對卵巢顆粒細胞存活率的影響 與0%益腎疏肝湯組比較，其他劑量的益腎疏肝湯處理細胞后，5%、10%、80%、100%的益腎疏肝湯對細胞具有顯著影響(P<0.05)，而20%、0%、60%的益腎疏肝湯對細胞無明顯影響(P>0.05)。因此后續(xù)實驗益腎疏肝湯的中、低、高劑量分別選為20%、40%、60%。見表1。

表1 不同濃度的益腎疏肝湯對卵巢顆粒細胞存活率的影響(%，n=6)

2.2 不同濃度的雷公藤多苷對卵巢顆粒細胞存活率的影響 與0%雷公藤多苷組比較，其余劑量的雷公藤多苷處理細胞后，細胞存活率均顯著降低(P<0.05)；當使用60%的雷公藤多苷刺激細胞后，細胞存活率約為50%作用，因此后續(xù)實驗雷公藤多苷的劑量選擇60%。見表2。

表2 不同濃度的雷公藤多苷對卵巢顆粒細胞存活率的影響(%，n=6)

2.3 益腎疏肝湯可扭轉雷公藤多苷對卵巢顆粒細胞增殖的抑制 與正常組比較，損傷組細胞24、48、72 h的OD值均顯著降低(P<0.05)；與損傷組比較，中藥低、中藥中劑量組、中藥高劑量組在48、72 h的OD值均顯著增加(P<0.05)；同時中藥低、中藥中劑量組、中藥高劑量組之間在48、72 h的OD值差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞不同時間點OD值的比較

2.4 益腎疏肝湯對雷公藤多苷誘導的卵巢顆粒細胞凋亡的影響 與正常組比較，損傷組TUNEL陽性細胞率、Bax和cl-caspase-3蛋白表達水平均顯著增加(均P<0.05)，而Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與損傷組比較，陽性對照組以及中藥低、中藥中劑量組、中藥高劑量組的TUNEL陽性細胞率、Bax和cl-caspase-3蛋白表達水平均顯著增降低(均P<0.05)，而Bcl-2蛋白水平顯著上升(P<0.05)；且各指標在中藥低、中藥中劑量組、中藥高劑量組之間的差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖1～2和表4。

表4 各組TUNEL陽性細胞率及凋亡相關蛋白表達水平比較

圖1 TUNEL法檢測各組細胞凋亡情況

圖2 蛋白質印跡法檢測各組細胞凋亡相關蛋白表達情況

2.5 益腎疏肝湯對卵巢顆粒細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響 與正常組比較，損傷組細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與損傷組比較，陽性對照組以及中藥低、中藥中劑量組、中藥高劑量組的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)，且呈劑量依賴(P<0.05)。PI3K、AKT、mTOR蛋白水平在各組之間差異均無統計學意義(均P>0.05)。見圖3、表5。

圖3 各組細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達情況

表5 各組細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

3 討論

卵巢顆粒細胞是卵巢中的主要功能細胞，在卵母細胞的發(fā)育中扮演著重要的角色，從原始的卵泡生長啟動開始到增殖、分化以及閉鎖、排卵以及黃體形成，卵巢顆粒細胞在形態(tài)以及功能上均發(fā)生了變化[19]。雷公藤多苷是從中藥雷公藤根莖中提取的化合物，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調節(jié)等功效，但對女性而言，可導致卵巢器官的藥源性損傷，引起卵巢功能減退[20]。龍旭[18]應用雷公藤多苷含藥血清干預大鼠卵巢顆粒細胞后細胞凋亡明顯，本研究亦用此造模方法，并篩選出了最適合的藥物干預劑量。而近年來，中藥治療雷公藤多苷導致的卵巢顆粒細胞凋亡的作用被證實，陸柳如[21]研究發(fā)現補腎活血方可通過加快顆粒細胞的有絲分裂信號轉導，加強卵巢顆粒細胞的增殖，促進卵泡的生長，緩解雷公藤多苷導致卵泡發(fā)育障礙。益腎疏肝湯是由女貞子、熟地黃、墨旱蓮、北沙參、甘草、丹參等配伍的中藥方劑，具有通行血脈，清血分之熱及活血調經，改善卵巢功能的功效。然而益腎疏肝湯對改善卵巢功能的作用機制還不清楚，本研究發(fā)現益腎疏肝湯可調節(jié)大鼠卵巢顆粒細胞的存活率，這提示益腎疏肝湯可能通過調節(jié)卵巢顆粒細胞改善卵巢功能。使用雷公藤多苷刺激細胞后，細胞的存活率顯著降低，而益腎疏肝湯含藥血清可顯著削弱雷公藤多苷對細胞增殖的抑制作用，表明益腎疏肝湯含藥血清可減輕雷公藤多苷對卵巢顆粒細胞的損傷。

卵巢顆粒細胞凋亡是卵泡發(fā)育和卵巢功能的重要環(huán)節(jié)，不正常的卵巢顆粒細胞凋亡影響卵巢的功能，Bax、Caspase-3、Bcl-2是凋亡過程中重要的凋亡調節(jié)分子，Caspase-3是卵巢顆粒細胞凋亡的主要信號轉導通路，當凋亡發(fā)生時線粒體途徑介導的Bax表達升高，并引起Caspase的級聯反應，進一步誘導凋亡，Bax與Bcl-2可形成二聚體，共同誘導凋亡[22-23]。張雙等[24]、嚴如根等[25]通過實驗研究發(fā)現補腎類復方可抑制大鼠卵巢顆粒細胞凋亡，改善卵巢功能，其機制可能與調控Bcl-2相關線粒體凋亡信號通路有關。本研究結果顯示，雷公藤多苷可顯著誘導大鼠卵巢顆粒細胞凋亡，且增加Bax、cl-caspase-3的蛋白表達水平，抑制Bcl-2蛋白的表達，而益腎疏肝湯含藥血清可顯著降低雷公藤多苷對顆粒細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2表達的調控，且呈劑量依賴性。這提示，益腎疏肝湯含藥血清可通過抑制細胞凋亡途徑減少雷公藤多苷對大鼠卵巢顆粒細胞的損傷。

進一步探究益腎疏肝湯含藥血清調控顆粒細胞的分子作用機制，我們發(fā)現益腎疏肝湯含藥血清可上調顆粒細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平。研究表明PI3K/AKT信號通路在卵巢顆粒細胞的分化中扮演重要角色，當小鼠卵巢顆粒細胞的AKT1基因被敲除后，顆粒細胞的存活率明顯降低，且小鼠卵巢中的卵泡數量明顯減少。當PI3K/AKT通路被激活后，PI3K、AKT磷酸化水平增加，進一步激活下游基因mTOR，并發(fā)揮著促進細胞增殖的作用[26-27]。研究發(fā)現中藥復方可提高卵巢顆粒細胞中PI3K、mTOR的表達，抑制AKT表達，從而調節(jié)卵泡發(fā)育，抑制卵泡閉鎖、改善卵巢功能[28-30]。本課題中雷公藤多苷可抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達，而益腎疏肝湯含藥血清可顯著降低雷公藤多苷對p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達的影響。

綜上所述，益腎疏肝湯含藥血清可能通過調節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路，調節(jié)凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，減輕雷公藤多苷對卵巢顆粒細胞凋亡的影響。