李秀芳 王忠清 朱 蕾 張小平 徐海燕 連 方

(1 山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，濟南，250000； 2 山東大學附屬生殖醫(yī)院，濟南，250021； 3 山東中醫(yī)藥大學眼科與視光醫(yī)學院，濟南，250000； 4 濟南金齡健康護理院，濟南，250000； 5 空軍濟南基地保障部門診部，濟南，250002； 6 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中西醫(yī)結合生殖與遺傳中心，濟南，250000)

近年來，隨著社會的發(fā)展、工作和生活壓力的增大，女性生育年齡逐漸增大。35歲以后生育第1個孩子的比例從1970年的1/100增加到2006年的1/12[1-2]。而年齡與卵巢儲備功能密切相關，可作為預測女性生育能力的一個獨立因素，女性在35歲以后生育力明顯下降[3-4]。隨著二胎政策的放開，中國有9 000萬對夫婦符合生育條件[]，其中60%為35歲以上高齡女性[5-7]。這部分女性卵巢儲備功能下降，臨床妊娠率低，如何提高高齡不孕女性的生育力是關系國計民生的重要問題。

目前，35歲以上高齡不孕女性，選擇輔助生殖技術(Assisted Reproductive Technology，ART)治療的高齡不孕女性數量在世界范圍內迅速增長[8-9]。但其助孕結局往往并不理想。國外有研究表明，35歲以上女性在體外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer,IVF-ET)周期中，胚胎種植率開始下降，每增加一歲，胚胎種植率降低2.77%，年齡超過44歲的女性胚胎種植率只有2.3%[10]；同時臨床妊娠率急劇下降，自然流產率升高[11]。高齡不孕女性竇卵泡數減少，卵母細胞質量下降，IVF-ET周期中使用大量外源性促排卵藥物，反復刺激卵巢，可誘導氧化應激反應，降低卵母細胞質量[12]。卵母細胞質量是影響妊娠成功的關鍵因素，并隨著年齡的增長而下降。為解決這一難題，生殖醫(yī)師在臨床實踐中采用多種策略來提高卵巢反應，比如添加輔酶Q10、脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)、生長激素(Growth Hormone，GH)等，但研究結果尚有爭議。補腎中藥作為中醫(yī)學的重要組成部分，大量研究表明，在高齡女性IVF-ET周期中，補腎中藥能夠改善卵母細胞質量，減少促性腺激素(Gonadotropins，Gn)用量，提高正常受精率及優(yōu)質胚胎率，改善高齡不孕女性的臨床妊娠結局[11-36]。推測可能與補腎中藥改善高齡女性卵細胞氧化應激損傷、抑制顆粒細胞凋亡有關，但是其確切機制尚不十分清楚。

1 高齡不孕與氧化應激關系的研究進展

高齡女性的生育能力急劇下降與卵母細胞數量和質量下降密切相關。女嬰在出生時卵巢中有100萬～200萬個卵母細胞，此后不再產生新的卵母細胞，相反會不斷丟失。有研究表明，在青春期，卵母細胞的數量已經減少到10萬～30萬，到了30歲后期，特別是35歲以后，卵母細胞的數量減少更加明顯[17]。盡管卵母細胞數量和質量下降的原因比較復雜，但氧化應激的影響已引起越來越多的關注，普遍認為體內活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)引起的氧化應激可導致高齡女性的卵母細胞線粒體功能障礙。有報道稱，衰老引起的抗氧化功能下降與卵母細胞質量下降有關[18-19]。

氧化應激是指ROS產生過多，超過了機體的抗氧化防御水平，造成的一種氧化與抗氧化失衡狀態(tài)，從而引起組織與細胞損傷的現象[20-21]。在生理狀態(tài)下,90%的ROS來源于線粒體氧化磷酸化過程[22]。ROS在生殖過程中具有重要作用，影響卵母細胞的生長、發(fā)育和成熟以及排卵、受精、胚胎著床和胚胎發(fā)育[23]。在排卵過程中，由于黃體生成素(Luteinizing Hormone，LH)的升高以及卵泡內新生血管的形成，血管內皮細胞會產生大量的ROS，這為卵母細胞成熟和卵泡破裂提供了必要的條件。然而，過量的ROS會引起細胞損傷。作為一種對抗ROS的防御機制，卵泡和卵母細胞內存在抗氧化酶和抗氧化劑，使卵母細胞免受氧化應激的損傷，其中酶類抗氧化劑包括過超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、氧化氫酶(Catalase，CAT)、還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathion Peroxidase，GSH-Px)等；非酶類抗氧化劑包括維生素C、維生素E、GSH、類胡蘿卜素、褪黑素等[2-25]。如果ROS水平與抗氧化系統不平衡，容易使卵母細胞和顆粒細胞受到氧化應激的破壞，影響卵母細胞質量。氧化應激在女性生殖系統的生理、病理過程中起著重要作用，是引起女性生殖功能下降的重要因素。

1.1 氧化應激與卵母細胞質量下降 氧化應激是高齡女性卵母細胞質量下降的主要原因[26]。氧化應激可能是卵母細胞衰老和生殖疾病的“始發(fā)者”，是引起卵泡異常閉鎖、減數分裂異常、受精率降低、胚胎發(fā)育延遲的主要原因[27]。線粒體與卵母細胞質量下降密切相關，在卵母細胞線粒體內含有一套自己獨有的遺傳體系，稱為線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)。有研究指出，衰老會引起mtDNA的氧化損傷，mtDNA拷貝數不足會造成卵母細胞發(fā)育潛能降低[28]。mtDNA拷貝數與年齡及卵巢儲備關系密切，卵巢儲備差的高齡女性mtDNA拷貝數顯著下降[29-31]。根據生殖衰老理論，高齡女性的卵母細胞質量下降是由線粒體端?？s短引起的，ROS水平過高可引起不同類型的端粒DNA損傷，引發(fā)(局部端粒)單鏈斷裂(Single-strand Breakage，SSB)，影響端粒上端粒重復RNA(TElomeric Repeat-containing RNA,TERRA)的轉錄或保護蛋白的結合，導致端?？s短，造成卵母細胞質量下降[32-34]。

線粒體功能障礙是卵母細胞衰老的焦點[35]。J?nsson等[36]研究發(fā)現，當氧化還原反應發(fā)生時，線粒體中的電子通過呼吸鏈的復合物Ⅰ、Ⅲ轉移給氧，使氧化磷酸化活性增強，ROS產生增加。由于mtDNA結構的特殊性，當ROS過高時，容易與mtDNA結合，導致突變，引起線粒體功能障礙，影響電子傳遞鏈，發(fā)生電子泄露，與氧分子結合生成大量的ROS，造成惡性循環(huán)，導致卵母細胞損傷及線粒體自噬，不能產生足夠的腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)，影響卵子和胚胎發(fā)育。

氧化應激可導致高齡女性胚胎發(fā)育不良，臨床妊娠率降低[37-38]。高水平的ROS是IVF-ET失敗的主要原因[39]。卵泡液中顆粒細胞ROS高的患者，獲得卵子的概率較低，同時胚胎種植率也較低[40]。Carbone等[41]發(fā)現高齡女性卵泡液中的CAT及SOD水平明顯低于育齡期女性。溫燦鑫等[42]研究發(fā)現高齡女性卵泡液ROS增加、SOD活性降低，顆粒細胞中CAT及GSH水平顯著降低，并且卵泡液的SOD活性影響卵母細胞質量以及受精率，最終影響胚胎發(fā)育潛能及囊胚形成。Al-Saleh等[43]研究發(fā)現，卵泡液中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量越高，對顆粒細胞DNA的損傷就越嚴重；而CAT可清除卵泡液中ROS，具有抗氧化作用，卵泡液中CAT水平增加，提高了受精率，增加了活產率，對IVF-ET臨床結局產生積極影響。

1.2 氧化應激與細胞凋亡 ROS水平升高可能會引起DNA、RNA、碳水化合物、蛋白質和脂質氧化，從而造成不可修復的細胞損傷，導致細胞凋亡[44]。細胞凋亡在機體內環(huán)境的維持和多個系統的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，受B細胞淋巴瘤2(B-cell Lymphoma-2，Bcl-2)家族和胱天蛋白酶家族等多個基因的嚴格調控。Bcl-2家族蛋白是通過調節(jié)促凋亡與抗凋亡之間的平衡來維持線粒體完整性的一類關鍵蛋白[45]。Bcl-2相關X蛋白(Bcl2-Associated X,BAX)可通過增強線粒體膜通透性，改變跨膜電位，從而促使線粒體內細胞色素C釋放到細胞質中，引起半胱氨酸天冬氨酸酶的級聯反應，最終導致胱天蛋白酶-3被激活，引發(fā)細胞凋亡[46-48]。Bcl-2蛋白可以通過抑制凋亡蛋白引發(fā)的一系列信號激活發(fā)揮抗凋亡作用[49-50]。氧化應激可引起顆粒細胞凋亡，導致17β-雌二醇(Estradiol，E2)水平降低，排卵率降低，影響卵母細胞質量[51]。氧化應激介導的顆粒細胞凋亡減少了顆粒細胞-卵母細胞之間的聯系，從而減少了卵母細胞的營養(yǎng)供應，進一步影響卵母細胞的質量[52]。Lee等[53]報道顆粒細胞凋亡與年齡有關，高齡IVF-ET患者顆粒細胞的凋亡率高。有研究結果顯示，顆粒細胞的ROS水平和凋亡率都對IVF-ET的妊娠結局產生不利影響，二者在未妊娠組的表達水平要明顯高于妊娠組[54]。

細胞凋亡主要有3種途徑：線粒體介導的內源性凋亡途徑、死亡受體介導的外源性凋亡途徑以及內質網介導的凋亡途徑。其中線粒體介導的內源性凋亡途徑是氧化應激引起卵母細胞凋亡的重要途徑[55-56]。研究表明,氧化應激是導致卵母細胞和顆粒細胞凋亡的關鍵因素，過高的ROS激活線粒體介導的細胞凋亡信號通路,誘導顆粒細胞凋亡,導致卵母細胞閉鎖[57-59]。卵母細胞凋亡的實質就是細胞內氧化系統與抗氧化系統之間動態(tài)平衡被打破的結果。

2 補腎中藥在減輕氧化應激損傷中的研究進展

2.1 理論基礎 中醫(yī)學認為，腎主生殖，腎氣由盛轉衰貫穿于女性由年輕至衰老的全過程?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩疲骸芭悠邭q，腎氣盛，齒更發(fā)長。二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……五七，陽明脈衰，面始焦，發(fā)始墮。六七，三陽脈衰于上，面皆焦，發(fā)始白。七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也?！庇纱丝梢姡幼晕迤唛_始，陽明脈氣由盛轉衰，天癸開始衰竭，身體功能尤其是生殖功能開始減退，機體呈現“腎虛”的生理狀態(tài)，這與西醫(yī)學的高齡定義是一致的。在IVF-ET超促排卵的過程中，多個卵泡同時生長發(fā)育，腎必然分泌大量的腎精與天癸，導致腎氣一時性的旺盛，從而引起人體腎陰(腎精)、腎氣的耗損，在高齡女性中尤為突出。

腎是通過“腎-天癸-沖任-胞宮”軸來實現對女性生殖功能的統攝作用的，羅元愷教授首次提出了此理論，認為腎氣、天癸、沖任是與女性生殖關系最密切的物質，它們對女性的生長發(fā)育、生殖衰老起著非常重要的作用[60-61]。中醫(yī)的生殖軸與西醫(yī)學的下丘腦-垂體-卵巢軸雖分屬不同的理論體系，但是它們的調節(jié)機制大致是相同的。許潤三認為中醫(yī)的腎氣相當于西醫(yī)學的下丘腦，主宰著天癸、沖任；天癸相當于垂體；沖脈相當于卵巢，沖脈為血海，沖脈盛衰與血海盈虛關系密切，調控著月經的來潮；任脈主胞胎，為妊養(yǎng)之本，相當于子宮[62]。連方教授提出了“卵巢為奇恒之臟”，按照中醫(yī)藏象理論，卵巢是實體臟器，在形態(tài)上與五臟相似，具有奇恒之臟的特征[63]；而在功能上，與六腑類似，具有藏、泄雙重功能。卵巢周期性的長卵、排卵過程，對應了奇恒之臟的藏、泄功能，長卵為“藏”，排卵為“泄”。卵巢藏泄有時，女子生殖周期正常，方能孕育胞胎。卵巢的藏泄功能依賴于腎的統攝作用。腎中精氣充盛，天癸泌至有常，卵泡才能正常生長、排出，女性的生殖功能才能實現。但是高齡女性往往呈現腎中精氣不足的狀態(tài)，天癸泌至失司，沖任血海虧虛，不能滋養(yǎng)胞宮，影響胞宮的胎孕功能，而不能攝精成孕。因此，在臨床上，補腎中藥可用于治療高齡女性不孕癥，提高高齡女性的懷孕率。李麗等[64]通過補腎法對高齡女性IVF-ET妊娠結局影響的Meta分析，發(fā)現補腎法能增加高齡IVF-ET女性獲卵數和人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，hCG)水平、改善子宮內膜厚度、降低子宮血流阻力指數，從而提高臨床妊娠率。

2.2 補腎中藥的抗氧化作用

隨著抗氧化機制研究的不斷深入，補腎中藥在抑制細胞凋亡、改善氧化應激方面的作用受到了越來越多的關注，臨床工作者對單味中藥提取物(包括補腎陰中藥、補腎陽中藥)和中藥復方抗氧化作用開展了諸多研究。

2.2.1 補腎陰中藥 在補腎陰中藥中，高齡IVF-ET患者使用最多的是熟地黃，熟地黃味甘、微溫，歸肝、腎經，功效滋陰養(yǎng)血，補精益髓，為補血與滋陰之要藥[64]?，F代藥理學研究表明，熟地黃含地黃素、地黃苷、氨基酸、梓醇、糖類以及多種微量化學元素，具有抗氧化、抗衰老及促進造血、抗疲勞、增強免疫力的作用[65]。秦亞東等[66]研究發(fā)現白芍具有抗氧化功能，研究者給小鼠頸背部注射D-半乳糖后，發(fā)現模型小鼠血清中抗氧化物SOD、GSH的表達明顯下降，而MDA的表達水平上升，提示存在氧化應激；給予白芍多糖治療后，衰老小鼠血清中SOD、GSH活性升高，同時MDA的活性顯著降低。當歸具有補血活血的功效，其提取物當歸多糖對體內自由基有較強的清除能力，能夠調控SOD和GSH-Px活性，對H2O2誘導的小鼠細胞氧化應激損傷有保護作用，具有抗炎和抗凋亡作用[67]。鄂志強等[68]將從石斛中提取的生物堿-石斛堿(Dendrobine，DNE)作為抗氧化劑添加到小鼠卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基中，結果發(fā)現DNE可顯著降低小鼠卵母細胞的ROS水平，提高小鼠卵母細胞的GSH水平，改善氧化應激，提高卵母細胞質量。由此可見，補腎陰中藥在抗氧化中發(fā)揮著重要作用。

2.2.2 補腎陽中藥 補腎陽中藥在生殖系統中的作用主要是性激素樣作用，補腎陽中藥大多具有抗氧化、延緩衰老的作用。李利娟等[50]研究發(fā)現，菟絲子總黃酮能夠通過增加抗凋亡因子Bcl-2表達，降低促凋亡因子的Bax和胱天蛋白酶-3表達，減輕丙烯醛誘導的小鼠生殖細胞的損傷，發(fā)揮抗凋亡、抗氧化的作用。趙巖等[69]通過對管花肉蓯蓉不同部位的藥理研究發(fā)現，肉蓯蓉中含有豐富的多酚、三萜、多糖、苯乙醇苷類等生物活性物質，對自由基具有較強的清除能力和抗氧化作用，且不同部位的抗氧化能力強弱順序為根部>中部>頂部。劉春紅等[70]研究發(fā)現鹿茸提取物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2，2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid，ABTS]自由基的能力較強，線蟲飼喂鹿茸提取物后能顯著延長其在氧化應激條件下的生存時間，延長壽命，提高生殖能力，具有抗衰老作用，且發(fā)現抗氧化作用可能與線粒體信號通路有關。發(fā)酵巴戟天中含有豐富的多糖、寡糖與蒽醌，三者對ROS自由基均有較強的清除能力，復配具有協同抗氧化作用，提示巴戟天可延緩衰老，延長壽命[71]。馬蔚蓉和談勇[72]通過雷公藤苷灌胃構建小鼠卵巢早衰模型，發(fā)現模型小鼠原始卵泡、竇卵泡、成熟卵泡、黃體數量下降，血清中SOD、CAT水平降低，顆粒細胞中ROS水平上升，核因子E2相關因子2(Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor 2，Nrf-2)、血紅素氧化酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)蛋白和mRNA表達降低，表明存在氧化應激。金絲桃苷(可從菟絲子中提取)治療4周后，竇卵泡數和黃體數增加，血清中SOD、CAT、E2和抗米勒管激素(Anti-Müllerian Hormone，AMH)水平上升，顆粒細胞中ROS水平降低，氧化應激因子(Nrf-2、HO-1)和抗凋亡因子磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphorylated Phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated Protein Kinase，p-AKT)、Bcl-2表達升高，凋亡相關因子Bax和胱天蛋白酶-3表達下降，表明金絲桃苷具有抗氧化、抗凋亡作用，抑制早發(fā)性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency，POI)小鼠卵巢顆粒細胞凋亡，一定程度上修復了卵巢氧化損傷，改善了卵巢功能。

2.2.3 中藥復方 中藥復方在抑制顆粒細胞凋亡、減輕氧化應激損傷方面發(fā)揮著重要作用。滋腎育胎丸可降低卵巢儲備功能減退(Diminished Ovarian Reserve，DOR)模型大鼠Bax表達水平，增強Bcl-2的表達，抑制顆粒細胞凋亡，防止卵泡過度閉鎖[73]。劉慧萍等[74]研究發(fā)現，補腎活血方通過抑制Fas、FasL基因的表達和提高E2水平，降低LH、FSH的水平，從而抑制卵泡顆粒細胞的凋亡。王玲[75]通過對經方左歸丸的研究發(fā)現，左歸丸可以通過抑制抗透明帶抗體的產生和抑制Fas介導的卵泡細胞凋亡使自身免疫性卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)模型小鼠的Bcl-2表達增加，FasL表達降低，細胞凋亡率明顯下降，從而改善小鼠卵巢及免疫功能。

二至天癸方是連方教授依據滋補腎陰之旨自擬的經驗方，由墨旱蓮、女貞子、菟絲子、枸杞子、白芍、當歸、熟地黃、川芎、制香附、炙甘草加減而成，為二至丸和四物湯的合方。周衡樸等[76]通過現代藥理研究發(fā)現二至丸含有綠原酸、特女貞苷、橄欖苦苷等成分。綠原酸可抑制氧化應激條件下磷酸化信號轉導子和轉錄激活子3的表達，促進Nrf2的表達，激活HO-1蛋白的表達，上調p-AKT蛋白的水平，起到抗氧化作用；橄欖苦苷抗氧化能力極強，可增加酶類抗氧化劑的水平，如SOD、GSH-Px、CAT，同時提高非酶抗氧化劑如GSH、β-胡蘿卜素等水平，也可直接清除ROS；特女貞苷可降低Bax、胱天蛋白酶-3的表達，促進Bcl-2的表達，起到抗凋亡作用。劉其南等[77]研究表明，二至丸能夠提高GSH-Px、SOD的活性，降低MDA的含量，減輕D-半乳糖誘導大鼠腎細胞的衰老程度。同時有研究發(fā)現，H2O2誘導的大鼠胰島細胞瘤細胞(Islet Cell Tumor Cells,INS-1)ROS水平明顯升高，二至丸能提高其抗氧化應激能力[78]。四物湯可以影響高齡雄鼠脾組織中花生四烯酸的表達，而花生四烯酸與氧化應激關系密切，對氧化應激有雙向調節(jié)作用，既能誘導產生氧化應激，也能抑制氧化應激[79-80]。課題組前期研究顯示，二至天癸方能改善高齡不孕癥患者的腎陰虛狀態(tài)，減少Gn用量，提高其正常受精率及可利用胚胎率[81]，可通過降低卵泡液內8-異前列腺素F2α(8-epi-prostaglandinF2α，8-isO-PGF2α)、晚期氧化蛋白產物(Advanced Oxidation Protein Products，AOPP)表達，增強抗氧化劑SOD的表達，調控高齡DOR患者的氧化應激反應，提高高齡患者卵細胞質量及胚胎發(fā)育潛能[15]；二至天癸方合并祛瘀解毒方可以抑制子宮內膜異位癥不孕患者卵泡液中ROS、顆粒細胞胱天蛋白酶-3蛋白的表達，影響卵巢的藏泄功能[82]。同時連芳和相珊[83]研究發(fā)現，二至天癸方可明顯改善不孕癥IVF-ET患者的腎虛癥狀，通過調控PI3K/AKT信號轉導通路，抑制顆粒細胞凋亡，改善卵母細胞質量，提高臨床妊娠率。

3 小結

通過總結以上內容，我們得知女性的臨床妊娠結局與年齡密切相關；高齡女性卵母細胞的氧化應激水平明顯增高，凋亡因子表達升高，加速了卵母細胞的閉鎖，導致高齡女性卵細胞質量下降，補腎中藥在高齡不孕女性的治療中表現出了多環(huán)節(jié)作用的特點，通過提高卵巢的抗氧化能力，改善卵巢儲備功能，提高卵細胞質量，改善高齡不孕女性體外助孕結局。但是補腎中藥減輕氧化應激損傷的具體作用機制目前尚不清楚，值得進一步探究。

4 討論

近幾年來，中藥在減輕氧化應激損傷方面的研究日益增多，補腎陰中藥、補腎陽中藥和中藥復方在抗氧化損傷中表現出了積極的作用。但是目前補腎中藥在高齡不孕抗氧化治療中的研究較少，在今后的研究中需要進行多中心、大樣本、前瞻性研究以明確補腎中藥在高齡不孕IVF-ET患者中的臨床效果，并在此基礎上進一步探討其作用于卵巢的復雜機制，用大量的客觀數據資料證實中醫(yī)藥在高齡不孕IVF-ET患者中的價值，充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，探索中醫(yī)藥的抗氧化作用機制，以期為高齡不孕女性帶來福音。