◎ 孫 娜，燕如娟

（飛鶴（甘南）乳品有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 162100）

生化鑒定技術(shù)主要是根據(jù)不同種屬的微生物其酶系統(tǒng)、代謝途徑和代謝產(chǎn)物的較大差異，以及這些代謝產(chǎn)物的不同生化特征，從而對(duì)這些代謝產(chǎn)物加以生化測(cè)定進(jìn)而鑒定微生物的種類。

1 生化鑒定原理方法及注意事項(xiàng)

1.1 革蘭氏染色

1.1.1 革蘭氏染色的原理

革蘭氏染色是19世紀(jì)80年代由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立，可用于鑒別革蘭氏陰性菌與陽性菌，經(jīng)革蘭氏染色后的細(xì)菌可在鏡下清楚觀察到細(xì)菌的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征，可用以細(xì)菌分類鑒定。①革蘭氏陽性。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁較厚，主要成分由肽聚糖相互交聯(lián)而形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)菌被結(jié)晶紫溶液染色后利用乙醇進(jìn)行脫色時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層因失水而導(dǎo)致孔徑縮小以至關(guān)閉，使結(jié)晶紫與碘染色復(fù)合物無法脫色而被保留在胞內(nèi)，呈現(xiàn)藍(lán)紫色。②革蘭氏陰性。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，脂類物質(zhì)含量高，用乙醇進(jìn)行脫色時(shí)，細(xì)胞壁中的脂類物質(zhì)被乙醇溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使得結(jié)晶紫與碘染色復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，隨后被沙黃溶液復(fù)染著色，使細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。

1.1.2 操作方法

革蘭氏染色法包括初染、媒染、脫色和復(fù)染等4個(gè)步驟。涂片后固定載玻片，加龍膽紫液染色10 s，水洗，甩干；加碘溶液染色10 s，水洗，甩干；加脫色液脫色10～20 s，水洗，甩干；加沙黃溶液復(fù)染 10 s，水洗；待干，鏡檢。

1.1.3 注意事項(xiàng)

①要確保使用的革蘭氏染色試劑有效，并按照說明書進(jìn)行試驗(yàn)。②選用活躍生長(zhǎng)期菌種進(jìn)行染色，部分衰老或死亡的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁會(huì)自行溶解，使細(xì)胞壁通透性增加，從而被乙醇脫色，因此沙黃復(fù)染后會(huì)有假陰性的情況出現(xiàn)。③要均勻涂片，否則太厚的地方脫色不均勻。此外，固定時(shí)不要燒過，以免菌體萎縮以至于變形。整體涂片不宜過厚，以免脫色不完全而造成假陽性。④媒染時(shí)間不宜過長(zhǎng)。結(jié)晶紫與碘液作用時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其復(fù)合物過于牢固結(jié)合在菌體細(xì)胞壁上，影響乙醇脫色效果，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。⑤掌握合適的脫色時(shí)間。洗脫是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，應(yīng)嚴(yán)格控制在10～20 s以保證洗脫效果。洗脫時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致革蘭氏陰性菌體內(nèi)的結(jié)晶紫復(fù)合物不能被有效洗脫出來，使陰性菌出現(xiàn)假陽性；而洗脫時(shí)間過長(zhǎng)，革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)可能會(huì)被乙醇破壞，導(dǎo)致胞內(nèi)的結(jié)晶紫復(fù)合物被洗脫，出現(xiàn)假陰性。

1.2 糖發(fā)酵試驗(yàn)

糖發(fā)酵試驗(yàn)是腸道細(xì)菌鑒定中最常用的生化反應(yīng)，其目的在于檢測(cè)不同細(xì)菌利用各種碳源的能力。大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源，但不同的細(xì)菌表達(dá)不同的酶系，所以在分解糖類物質(zhì)的種類和能力上有很大差異[1]。實(shí)驗(yàn)室微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目中腸桿菌科的鑒定多用到葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，具體操作方法為用接種針挑取典型菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，若試管內(nèi)的內(nèi)容物變?yōu)辄S色，判為陽性反應(yīng)；不變色判為陰性反應(yīng)。此外，用接種針挑取典型菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂內(nèi)時(shí)，應(yīng)注意不要觸及試管底部。

1.3 吲哚試驗(yàn)

1.3.1 原理

吲哚試驗(yàn)又名靛基質(zhì)試驗(yàn)，其原理是基于某些細(xì)菌能夠分解色氨酸生成吲哚，吲哚可以與試劑中的對(duì)二甲氨基苯甲醛結(jié)合生成玫紅色的玫瑰吲哚，用以檢測(cè)細(xì)菌分解色氨酸的能力[2]。

1.3.2 操作方法及注意事項(xiàng)

按照API20E說明書使用棉簽拭子從分離物的平板上挑取已分離提純的單個(gè)菌落至安瓿瓶中，用毛細(xì)滴管反復(fù)吹打，制成均一的菌懸液，將菌液接種到小管及小杯中，利用石蠟油覆蓋指定的生化孔（有劃線的孔），蓋上蓋子進(jìn)行培養(yǎng)，按操作說明書規(guī)定，將附加試劑加進(jìn)小孔內(nèi)，進(jìn)行判讀。用接種環(huán)挑取菌落不容易混勻，還易挑到培養(yǎng)基對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾，可使用專用的棉簽拭子挑取菌落。

1.4 氧化酶試驗(yàn)

1.4.1 原理

氧化酶又稱細(xì)胞色素氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶C或呼吸酶，細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，該實(shí)驗(yàn)用以檢測(cè)細(xì)菌中是否存在該酶。該試驗(yàn)原理基于細(xì)胞中氧化酶可氧化細(xì)胞色素C，而氧化型細(xì)胞色素C可氧化四甲基對(duì)苯二胺，出現(xiàn)紫色反應(yīng)[3]。實(shí)驗(yàn)室可用氧化酶試驗(yàn)鑒定克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）以及腸桿菌科等。

1.4.2 操作方法及注意事項(xiàng)

在平皿中放置一張普通的濾紙并滴上氧化酶試劑。用接種環(huán)挑取一單獨(dú)的菌落在濾紙上涂抹少許。一張濾紙可進(jìn)行多個(gè)菌落的實(shí)驗(yàn)。觀察菌落15 s內(nèi)顏色的變化，若變成紫色或深紫色，為氧化酶陽性；不變色，為氧化酶陰性；同時(shí)滴1滴氧化酶試劑在沒有沾取菌落的濾紙上做陰性對(duì)照，應(yīng)不變色。此外，應(yīng)使用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒（不要用鎳鉻接種環(huán)）挑取單個(gè)菌落。

1.5 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)

1.5.1 原理

賴氨酸脫羧酶的原理基于某些能產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶的細(xì)菌可將賴氨酸脫羧生成堿性更強(qiáng)的胺和二氧化碳，經(jīng)溴甲酚紫指示劑染色后可使培養(yǎng)基呈紫色[4]。

1.5.2 操作方法及注意事項(xiàng)

用接種環(huán)或接種針挑取單個(gè)菌落，接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，必要時(shí)可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至48 h。實(shí)驗(yàn)室主要用于沙門氏菌的鑒定。在進(jìn)行沙門氏菌驗(yàn)證時(shí)，接種三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基時(shí)先于斜面劃線，然后再底層穿刺；接種針接種時(shí)應(yīng)注意不要滅菌，直接接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

1.6 尿素酶試驗(yàn)

1.6.1 原理

尿素酶試驗(yàn)的原理基于某些能夠表達(dá)尿素酶的細(xì)菌可分解尿素產(chǎn)氨，使培養(yǎng)基呈堿性[5]。因此，將被檢菌接種于相應(yīng)的尿素培養(yǎng)基，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，可以產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌分解尿素后培養(yǎng)基呈堿性，可以使酚紅指示劑變紅。實(shí)驗(yàn)室主要用尿素酶試驗(yàn)鑒定沙門氏菌。

1.6.2 操作方法及注意事項(xiàng)

用接種環(huán)或接種針挑取單個(gè)菌落，直接接種于尿素酶培養(yǎng)基，（36±1）℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48 h。此外，在進(jìn)行沙門氏菌驗(yàn)證時(shí)，接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)，可直接接種尿素酶。

1.7 三糖鐵瓊脂試驗(yàn)

1.7.1 原理

在進(jìn)行三糖鐵瓊脂試驗(yàn)時(shí)，可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃），產(chǎn)生硫化氫（變黑），實(shí)驗(yàn)室主要用三糖鐵瓊脂試驗(yàn)鑒定沙門氏菌。

1.7.2 操作方法及注意事項(xiàng)

在進(jìn)行沙門氏菌驗(yàn)證時(shí)，從選擇性瓊脂培養(yǎng)基上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，先于斜面上劃線，再于底層穿刺；于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48 h。在進(jìn)行沙門氏菌驗(yàn)證時(shí)，接種三糖鐵瓊脂要注意先在斜面劃線，再于底層穿刺。

1.8 血清學(xué)反應(yīng)

1.8.1 原理

在微生物分類鑒定中，血清學(xué)反應(yīng)是指利用血清學(xué)反應(yīng)的基本原理，將已知菌種或菌型的細(xì)菌免疫動(dòng)物制備抗血清，然后根據(jù)待檢微生物樣品是否能與其發(fā)生特異性的血清學(xué)反應(yīng)來鑒定未知菌種的方法。實(shí)驗(yàn)室主要用血清學(xué)反應(yīng)鑒定沙門氏菌。

1.8.2 操作方法及注意事項(xiàng)

按照說明書進(jìn)行試驗(yàn)，于載玻片上選取兩塊約 1 cm×2 cm的區(qū)域，用無菌接種環(huán)挑取待測(cè)菌接種于每塊區(qū)域的上部，于其中一塊區(qū)域的下方滴加多價(jià)菌體抗血清，另一區(qū)域下部滴加等量生理鹽水為陰性對(duì)照。然后用無菌接種環(huán)分別將兩區(qū)域的待測(cè)菌與抗血清（生理鹽水）研磨成乳液狀，并將載玻片傾斜，持續(xù)搖動(dòng)混合1 min，于黑暗背景下觀察凝集狀態(tài)，出現(xiàn)任何程度的凝集現(xiàn)象均可判定為陽性反應(yīng)。在進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)注意使用接種環(huán)或針將菌苔研成乳狀液時(shí)，先在生理鹽水中研磨，再進(jìn)行血清研磨。

1.9 過氧化氫酶試驗(yàn)

1.9.1 原理

過氧化氫酶試驗(yàn)的原理是黃酶系統(tǒng)的呼吸酶在電子傳遞鏈將氫傳遞給分子氧生成過氧化氫，而過氧化氫活細(xì)胞具有毒性，含有過氧化氫酶細(xì)菌可以催化過氧化氫使其分解為水和分子態(tài)氧。判定標(biāo)準(zhǔn)為30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡為陽性，不產(chǎn)生氣泡為陰性。革蘭氏陽性球菌中，葡萄球菌與微球菌可產(chǎn)生過氧化氫酶，因此該反應(yīng)呈陽性，而鏈球菌屬細(xì)菌過氧化氫酶反應(yīng)呈陰性，因此該反應(yīng)可用于區(qū)分葡萄球菌和鏈球菌，實(shí)驗(yàn)室多用于蠟樣芽孢桿菌與金黃色葡萄球菌的鑒定。

1.9.2 操作方法

用吸管吸1滴3%過氧化氫溶液在載玻片上。用無菌的塑料接種環(huán)或木制無菌牙簽挑取一單獨(dú)菌落與過氧化氫溶液混合。如果有氣泡產(chǎn)生，判定為過氧化酶陽性；沒有氣泡產(chǎn)生，判定為過氧化酶陰性。一般微球菌屬和芽孢桿菌屬為陽性結(jié)果，乳酸桿菌屬和鏈球菌屬為陰性結(jié)果。

1.9.3 注意事項(xiàng)

①自配的3% H2O2溶液，不能倒入長(zhǎng)有菌落的血瓊脂平板上，可能會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果。②不能用鉑金類或鎳合金類的接種針或接種環(huán)去混合培養(yǎng)物和3% H2O2溶液，可能會(huì)產(chǎn)生假陽性。③菌落較小時(shí)可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)論。

1.10 蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)

1.10.1 操作方法

挑取純培養(yǎng)的獨(dú)立可疑菌落接種于硫酸錳營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，并將平板置于室溫放置3～4 d，挑取少量培養(yǎng)物于載玻片上，加入蒸餾水混勻。自然干燥然后微火固定，加甲醇作用30 s后棄去，然后通過火焰進(jìn)行干燥，再于載玻片上滴滿0.5%堿性復(fù)紅，再次放火焰上加熱，1～2 min 后移去火焰，再更換染色液染色30 s，傾去染色液用蒸餾水徹底清洗、晾干后鏡檢。實(shí)驗(yàn)室可用于鑒別蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌。

1.10.2 注意事項(xiàng)

①菌液濃度過高，可能會(huì)導(dǎo)致非典型的結(jié)論。②在載玻片上滴滿0.5%堿性復(fù)紅時(shí)，在火焰上加熱需要微見蒸氣，注意不要使染液沸騰。③如發(fā)現(xiàn)游離芽孢的形成不豐富，應(yīng)將培養(yǎng)物置室溫2～3 d再進(jìn)行檢查。

1.11 動(dòng)力試驗(yàn)

動(dòng)力試驗(yàn)是有動(dòng)力的細(xì)菌會(huì)延穿刺路線擴(kuò)散生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)室主要用于蠟樣芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的鑒定。具體操作方法為用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動(dòng)力培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。有動(dòng)力的蠟樣芽孢桿菌應(yīng)沿穿刺線呈擴(kuò)散生長(zhǎng)。此外，用接種針挑取典型菌落進(jìn)行穿刺時(shí)，注意不要觸及試管 底部。

1.12 溶血試驗(yàn)

1.12.1 原理

溶血試驗(yàn)的原理基于某些細(xì)菌在代謝過程中可以產(chǎn)生能夠使人或動(dòng)物的紅細(xì)胞裂解的溶血素，因此將待檢細(xì)菌劃線接種于綿羊血平板后，可在菌落周圍觀察到明顯溶血圈。當(dāng)待檢菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血圈時(shí)，待測(cè)菌為完全溶血（β溶血）；當(dāng)待檢菌落周圍出現(xiàn)綠色溶血圈，待測(cè)菌為不完全溶血（α溶血）；當(dāng)待檢菌落周圍無溶血環(huán)則為不溶血（γ溶血）。實(shí)驗(yàn)室主要用于金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌以及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的鑒定。

1.12.2 操作方法及注意事項(xiàng)

挑取純培養(yǎng)的單個(gè)疑似菌落，接種至胰酪胨大豆羊血瓊脂培養(yǎng)基上，（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。典型菌落為淺灰色，且不透明，似白色毛玻璃狀，有完全溶血環(huán)或草綠色溶血環(huán)。用接種針挑取典型菌落時(shí)，注意不要觸及平皿底部。

1.13 血漿凝固酶試驗(yàn)

1.13.1 原理

血漿凝固酶試驗(yàn)的原理基于某些細(xì)菌產(chǎn)生的血漿凝固酶可以使血漿中的纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白。細(xì)菌分泌的凝固酶大致分為兩類。①一種凝固酶可直接結(jié)合于細(xì)菌的細(xì)胞壁，當(dāng)血漿中的纖維蛋白直接接觸時(shí)可將細(xì)菌凝集成顆粒狀，針對(duì)產(chǎn)生該種凝固酶的細(xì)菌多用玻片法進(jìn)行鑒定。②凝固酶也稱游離血漿凝固酶，指細(xì)菌將凝固酶分泌至胞外，在接觸血漿后將血漿中的纖維蛋白原凝集為纖維蛋白，多用試管法進(jìn)行檢驗(yàn)。判定標(biāo)準(zhǔn)為檢測(cè)6 h內(nèi)，待檢管和陽性對(duì)照管出現(xiàn)凝集，陰性對(duì)照管不凝集，凝固酶檢測(cè)為陽性。實(shí)驗(yàn)室主要用于金黃色葡萄球菌鑒定，一般凝固酶呈陰性的葡萄球菌多為非致病性，而凝固酶呈陽性的葡萄球菌多為致病性葡萄球菌。

1.13.2 操作方法

打開凍干血漿，每支西林瓶中加入0.5 mL無菌生理鹽水完全溶解，加BHI培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物0.2～0.3 mL， 并充分振蕩搖勻，放置于（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每間隔30 min觀察一次，觀察至6 h，如呈現(xiàn)凝固或凝固體積大于原體積的一半，可判定陽性結(jié)果。

1.13.3 注意事項(xiàng)

在進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)時(shí)，要同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性菌株和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照試驗(yàn)。

2 結(jié)語

生化鑒定技術(shù)有顯著的特異性，上述實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室的生化鑒定過程中不斷地實(shí)踐與總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的生化鑒定技術(shù)應(yīng)用到微生物鑒定中，給微生物檢測(cè)帶來新的機(jī)遇和發(fā)展。