李興旺

（山東省武城縣畜牧漁業(yè)發(fā)展中心，山東德州 253300）

非洲豬瘟（ASF）是家豬或野豬被非洲豬瘟病毒（ASFV）感染而出現病變現象的一種疾病，為出血性病毒病的一種。被ASFV感染的豬多表現為呼吸受到明顯限制、外部皮膚、內部器官不同程度的出血等，可給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大地沖擊。針對ASF暫且沒有很好的防治方法，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將該疾病列入通報名錄中。

1 非洲豬瘟病毒

早在20世紀初期非洲豬瘟就已出現過。2018年8月，中國沈陽也發(fā)現1例疑似疫情，經檢測確診為非洲豬瘟病毒。隨之而來的是中國大面積爆發(fā)非洲豬瘟疫情。作為動物傳染病的一種，相較于其他傳染病，非洲豬瘟的危害最大，致死率達100%。現在還沒有找到更好的防治措施。

非洲豬瘟病毒是一種DNA病毒，且是雙股線性的，分子組成復雜，具有極高的變異性能且蛋白極其豐富。DNA是雙鏈單分子線狀結構，且末端是共價閉合的，構成了非洲豬瘟病毒的基因組，其長度因毒株的不同而有所差異，范圍在170～190kb，ORE多達151個，可編碼蛋白數量達到150～200種。非洲豬瘟病毒在機體內的傳播主要通過在巨噬細胞內進行復制來躲避機體產生自我免疫，從而使機體受到傷害。

非洲豬瘟具有多種基因型，具有極高的頑強力，溫度和pH變化都不會對它產生影響，如果對其進行滅活處理，則需60℃的溫度，時間為20 min。病毒的存活在不同的寄宿環(huán)境中存活時間也不相同。它可以在排泄物、尸體、新鮮肉類和其他肉類產品中寄生。非洲豬瘟病毒對生存溫度適應性極高。無論是常溫、低溫、高溫都有相當長的壽命。存活時間在常溫、4℃以下、凍肉中分別為6個月、1年、數年。

非洲豬瘟在豬群的發(fā)病順序通常為公豬、母豬、育肥豬、仔豬。感染非洲豬瘟的豬的發(fā)病表現，初期表現為高熱癥狀，這時養(yǎng)殖戶會錯誤的診斷為發(fā)燒并針對發(fā)燒進行治療，由于和發(fā)燒癥狀產生混淆，結果會導致病豬死亡速度加快，還會使得針孔注射處長時間的流血，這時就可以初步判定為非洲豬瘟。更明顯的癥狀為體態(tài)表征發(fā)生肉眼可見的變化，耳朵出現紫色、大片的紫斑出現在體表。如果對受感染的死豬進行尸檢，會發(fā)現其內臟器官均出現程度不一的出血癥狀，這也可作為非洲豬瘟的一大重要特點。此外，還可能會出現吐血的癥狀，呼吸受到抑制、咳嗽、便秘，臨床表現多樣。

非洲豬瘟病毒可通過多種方式進行傳播，如跨區(qū)域傳播、人車傳播、環(huán)境媒介傳播、品種傳播等。其感染途徑和其傳播途徑均有很多，如通過消化道、呼吸道等使得豬群感染。病毒如何在體內進行復制增殖呢？其過程為 ASFV運用胞吞的方式進入其靶細胞單核巨噬細胞體內，從而達到復制增殖的目的。受感染的豬群在發(fā)病初期，病毒粒子存在于豬肺泡巨噬細胞中。伴隨著時間的延長，病毒進行大規(guī)模的擴散導致病毒血癥的形成，病毒的存在場所也會擴散到腸道、腎臟等器官。ASFV入侵感染宿主機體的過程中有多種病毒結構蛋白如P30、P12、P54等參與其中，因此可以利用上述結構蛋白的特異性抗體，對上述病毒入侵過程進行阻斷達到預防的目的[1]。

該病毒的DNA復制過程與在胞漿中進行復制的痘病毒的復制過程有類似的地方，復制開始在病毒入侵細胞后，聯體的DNA中間體會被觀察到在細胞內。從核周開始病毒形態(tài)的產生，隨后由波形蛋白和線粒體圍繞。在病毒粒子中，其內脂質膜的構成，來源于內質網的脂質膜。被ASFV強毒株感染的豬只，其死亡速度極快，機體免疫系統完全來不及反應，以至于無法通過其豬只分離抗體。但被弱毒株感染的豬只，是可以在康復后進行抗體檢測、分離，并得到高水平抗體的結果。這些抗體的產生雖然可以成為病毒粒子對巨噬細胞再次發(fā)起侵害的阻礙，降低豬只再一次發(fā)病的概率，但豬體內仍有病毒存在，而且傳染性依然存在。由此可得弱毒株病毒會使豬只受到多次感染，從而證明ASFV可以很好的避開機體細胞免疫系統，其途徑主要是ASFV基因編碼一些能夠調節(jié)宿主細胞免疫反應的蛋白，利用這些蛋白干擾巨噬細胞被入侵所釋放信號的傳遞，從而抑制免疫基因的表達阻斷細胞免疫應答。如何及時的發(fā)現、檢測該病毒，找到行之有效的檢測方法迫在眉睫。

當前，聚合酶鏈反應（PCR）作為在各個行業(yè)都發(fā)揮了其成熟、有效的檢測作用的一種分子生物學檢測技術，運用PCR技術非洲豬瘟病毒進行專項檢測對非洲豬瘟的防治和診治具有建設性意義。

越早對豬瘟進行診斷，越有利于豬瘟的防治。診斷時，要有理有據，通過病豬的臨床表現，來確定診治方法、診治藥物等，早發(fā)現早扼制，有利于豬瘟的防治，從而使豬瘟得到有效控制。PCR 技術越來越成熟，并在檢測動物疫病方向發(fā)揮重要作用，也可作為傳統血清學的替代物。將成熟檢測技術的經驗加以借鑒進行檢測試驗，可廣泛運用于收益診斷，在縮短檢測時間的同時，大大提高了檢測結果的準確性，減少了由于非洲豬瘟疫情給養(yǎng)殖行業(yè)帶來的經濟折損。RT-PCR 技術的應用顯著提高了檢測效率，可有效規(guī)避樣本污染及假陽性結果的問題。借助于熒光定量 PCT 檢測的高特異性和高靈敏性，讓豬瘟病原體檢測快捷準確[2]。

2 RT-PCR技術

RT- PCR的本質為逆轉錄PCR，也就是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術[3]。首先通過反轉錄酶將RNA合成為cDAN；然后再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術由于其靈敏度高且被運用在各個領域，因而在細胞領域也被廣泛運用來檢測基因表達水平。RNA模板的來源有3種，分別為總RNA、mRNA、體外轉錄的RNA產物。無論使用哪種，最重要的是保證RNA中沒有RNA酶且基因組不會受到污染。對于反轉錄引物的選擇，需根據實驗的具體情況進行選擇，可供選擇的引物有隨機引物、Oligo dT及基因特異性引物。3種任選哪一種都適合的情況為其真核細胞的mRNA是短的且無發(fā)卡結構。

非洲豬瘟病毒檢測方法很多，如細胞接種、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）、聚合酶鏈反應（PCR）、實時定量PCR（realtimePCR）等。ASFV具有適合在非常規(guī)細胞中生存的特點，有散毒的隱藏風險。如果要檢測抗體的水平高低，最好選擇ELISA進行檢測，但其不能判定ASFV。LAMP的特點易操作，靈敏度高，其缺點會造成氣溶膠污染現象，最關鍵的是多出現假陽性結果，導致檢測有較大的失誤。而real-timePCR也會出現一系列問題，成本高、環(huán)保效能低。相比較而言，PCR技術應用范圍廣，也能規(guī)避上述檢測方法存在的問題，因此動物疾病的診斷治療檢測多用PCR方法，特別對于診斷中、低毒力感染或慢性病例非常有用，是早期診斷的首選。

3 檢測步驟

3.1 采集樣品

樣品要從ASFV易產生復制的病變部位進行采集，首先從病豬身上采集血液、脾臟、淋巴結等組織樣本，在其樣本上接種諸如豬肺泡巨噬細胞這樣的原代細胞。玫瑰花環(huán)指將豬紅細胞注射進正在培養(yǎng)的細胞組織中，這時豬紅細胞周圍呈現出包圍狀態(tài)，此狀態(tài)由絕大多數的ASFV對紅細胞產生吸附所形成[4]。并不是所有的非洲豬瘟病毒株都會吸附紅細胞，也會有一部分被不會發(fā)生吸附反應，如果在分離培養(yǎng)的組織中沒有出現吸附反應而是產生了細胞裂變，這時就需免疫熒光和PCR技術對細胞檢測，確認是否細胞被感染；還要注意在檢測過程中，運用免疫熒光和 PCR 確認為陰性需要傳代 3-5 次成陰性反應才可以被認可為陰性。

3.2 檢測步驟

檢測需設置對照，對照材料從動物疫病防控中心獲取，將因生病致死的豬只的扁桃體和淋巴結部位取樣備用。

檢測可分為5個步驟，如下：

（1）引物的合成：需要合成特異性引物，此過程需運用RT-PCR技術，并將擴增片段設計為682 bp。

（2）樣品的制備：首先要對因病致死的豬只尸檢；其次要取出病豬的扁桃體和淋巴結部位以供檢測，注意采集時要在無菌環(huán)境下進行；然后對取出的部位處理，先將其研磨后加生理鹽水稀釋；最后離心，離心條件為5000 r/s、5 min，取其上清液。

（3）將病毒基因組中的總RNA提取出來：此操作要按照試劑盒說明進行，將上層清液與SolutionR1混合，兩者量均為100 μl，混合后充分振蕩，時間30 s，在室溫中保存60 s；處理后加入SolutionR2 600 μl并搖勻，放在室溫下3～5 min；完成后，加入制備的上層清液并移至離心管內，離心30 s；將離心后的液體與Wash Buffer混合，再離心30 s，結束后將液體洗滌2次；在10000 r/min的條件下將空柱離心1 min，再轉到新的離心管中；獲得的新離心管需加入Spin column，再將Elution Buffer添加到膜中央，含量為20～50 μl，在室溫放置60 s后離心30 s可得到RNA，該RNA耐低溫，可保存在-70℃下，也可進行擴增處理。

（4）將RNA進行擴增處理：擴增需使用總RNA為模板進行，在45℃的溫度下，將上下游引物反轉錄30 min后，溫度升至94℃，預變5 min，變性30 s后，將溫度降至52℃，退火；在72℃的溫度下延伸45 s，完成35次循環(huán)操作。

（5）使用熒光法進行定量擴增：仍采用總RNA作為擴增模板，使用上下游引物、探針、Passive Reference Dye、RNA模板，前三者均加0.4 μl，RNA模板需加1 μl，并加入RNase-free Water，達到20 μl；將擴增程序設置在45℃，反轉錄25 min，溫度達到95℃時，預變2 min，變性10 s，溫度在55℃時，退火；溫度在72℃時延伸30 s，進行5個重復循環(huán)；最后在95℃的溫度下變性10 s，退火在55℃時進行，完成40個循環(huán)操作就可以收集熒光。

3.3 檢測結果

3.3.1 判定標準

判定依據以檢測Ct值為標準。判定為陽性樣品：Ct35，其擴增曲線呈增長趨勢。陰性或陽性樣品：35≤Ct≤40時要進行多次檢驗，若檢驗后，Ct 值仍然處于這一范圍，擴增曲線出現指數增長期，可以判斷為陽性，反之樣本為陰性。

判定為陰性樣品：Ct值不出現；Ct40。

3.3.2 擴增結果

提取樣本總RNA進行RT-PCR擴增處理，使用1%瓊脂糖凝膠對產物電泳，對照陽性片段。在682 bp附近，樣品有帶則可以確定樣本為豬瘟病毒陽性[5]。

4 結語

RT-PCR技術是一種成熟的檢測方法，檢測非洲豬瘟病效果好。