南曉強，楊浩峰，雷 鵬

(1.陜西省人民醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安 710068；2.渭南市中心醫(yī)院，陜西 渭南 714000)

痛風性關節(jié)炎(Gouty arthritis，GA)是由關節(jié)內尿酸鈉(Monosodium urate crystals，MSU)結晶異常，沉積引起的復發(fā)性慢性炎癥性疾病，為痛風最常見的首發(fā)癥狀之一，是男性和絕經后婦女最常見的炎癥性關節(jié)炎[1]。攝入過多富含嘌呤的食物是GA重要的致病因素，近年來隨著人們飲食習慣的改變，GA發(fā)病率逐年上升[2]。

急性痛風性關節(jié)炎發(fā)作雖然以自限性炎癥為特征，但發(fā)作時疼痛難忍，甚至可導致關節(jié)殘疾，高尿酸血癥被認為是本病最重要的獨立危險因素[2]。MSU長期沉積于滑膜或滑膜腔中可導致不可逆的關節(jié)損傷，伴有骨侵蝕及痛風結節(jié)形成[3]。研究發(fā)現(xiàn)關節(jié)內MSU晶體的存在并不一定會導致炎癥發(fā)作，但人體中性粒細胞、單核巨噬細胞、滑膜細胞、T淋巴細胞等均可與MSU晶體發(fā)生相關反應，釋放多種細胞因子，促使急性痛風性關節(jié)炎發(fā)作[4-5]。富半胱氨酸蛋白61(Cysteine-rich protein 61，Cyr61)是重要的促炎因子，參與炎癥微環(huán)境和自身免疫性疾病的調節(jié)[6-7]。正常情況下，Cyr61表達量較低，以維持機體生理需要，當外界刺激(如炎癥刺激、機械張力刺激等)時，其表達增加，進一步加重炎癥反應[8-9]。近期研究表明，Cyr61蛋白的高表達可以誘導痛風性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞產生大量炎癥因子[10]。

息痛散是本課題組經臨床實踐應用多年的效驗方，該方由生石膏、忍冬藤、蒼術、黃柏、牛膝、桃仁、全蝎組成。前期實驗證明該方可減輕痛風性關節(jié)炎模型大鼠足跖腫脹度，改善大鼠關節(jié)周圍組織炎癥反應，降低Caspase-1、TNF-α、NF-κB等炎癥指標表達[11-12]，但其作用機制有待進一步研究。鑒于此，本研究通過制備尿酸鈉晶體誘導的大鼠急性痛風性關節(jié)炎模型，觀察息痛散是否通過調節(jié)Cyr61表達水平，抑制炎癥因子，減輕炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：雄性SD大鼠50只，平均體重(250±20)g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。各組大鼠均置于潔凈動物房,室內持續(xù)12 h光照后再持續(xù)12 h避光處理，飼養(yǎng)期間按此循環(huán)給光；動物房室溫維持在22 ℃、濕度40%，自由攝水、進食，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.1.2 實驗藥物與試劑：尿酸鈉(批號U2875-5G)、秋水仙堿(批號H20113208)、Cyr61-shRNA慢病毒(上海吉凱基因公司)。

1.1.3 實驗儀器：全自動研磨儀(型號F-MM400，湖南弗卡斯實驗儀器有限公司)、臺式高速冷凍離心機(型號Sorvall Legend Micro 17，賽默飛世爾科技有限公司)、垂直電泳槽(型號165-8001，美國伯樂公司)、熒光定量PCR儀(型號LightCycler 480，美國羅氏公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備：采用Coderre和Wall改進的方法建立急性痛風性關節(jié)炎大鼠模型[13]。用1%戊巴比妥鈉皮下注射麻醉大鼠，將注射器從右踝關節(jié)外側與脛骨呈30°～45°方向插入踝關節(jié)腔內，注射尿酸鈉混懸液0.2 ml(2.5 g/100 ml)。如關節(jié)明顯腫脹，表明造模成功。正常組大鼠給予右踝關節(jié)注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 實驗分組：將50只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、息痛散組、息痛散聯(lián)合shRNA組、秋水仙堿組，每組各10只。根據(jù)人與動物體表面積換算，秋水仙堿組用藥劑量為3×10-4g/(kg·d)，息痛散組為72 g/(kg·d)；正常組、模型組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液，息痛散聯(lián)合shRNA組造模成功后立即將Cyr61-shRNA干擾慢病毒0.2 ml注射入關節(jié)腔，滴度為1E+7TU/ml。秋水仙堿組造模前劑量為1×10-4g/kg，造模后為3×10-4g/kg。其余各組灌胃給藥方法同前，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 指標檢測：關節(jié)腫脹指數(shù)的評估,在實驗前用記號筆在大鼠右踝關節(jié)處做標記。使用數(shù)字卡尺測量大鼠右踝關節(jié)周長，最小精度為0.01 mm。關節(jié)腫脹指數(shù)=(造模后-造模前)周長/造模前周長。每組重復3次，取平均值。血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平使用真空采血管采集大鼠腹主動脈血約5 ml，標號，放置2 h后用低溫高速離心機在4 ℃條件下3000 r/min離心15 min，取上清液進行分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA法測定大鼠血清中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平，嚴格按照試劑盒說明書所提供的方法及步驟操作，檢測前將所用試劑和樣本恢復至室溫。Western blotting檢測Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白含量,取等量的大鼠右側踝關節(jié)滑膜組織，每管組織加入400 μl裂解液，同時加入PMSF，取上清液進行蛋白質定量。隨后進行電泳、轉膜、封閉，使用一抗稀釋液將一抗稀釋成適宜濃度[Cyr61(1∶1000)、IL-1β(1∶1000)、TNF-α(1∶1000)、IL-6(1∶1000)]；4 ℃反應過夜；次日，用1×TBST洗膜3次；使用二抗稀釋液將HRP標記山羊抗兔抗體稀釋到1∶5000，室溫孵育膜60 min；再次用1×TBST洗膜3次，每次10 min；將膜浸入ECL發(fā)光液中，反應1 min；根據(jù)不同的發(fā)光強度調整使用Tanon-5200成像系統(tǒng)檢測目標靶蛋白；最后用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。應用實時定量熒光PCR(RT-PCR)檢測Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA含量,取大鼠右側踝關節(jié)滑膜組織，組織樣品用Trizol提取總RNA，并進行RNA定量，用All-in-One第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉錄，用熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析,引物序列見表1。

表1 基因引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠右踝關節(jié)腫脹指數(shù)比較 見表2。模型組、息痛散組、秋水仙堿組在造模各時間點的腫脹指數(shù)均高于正常組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示各造模組大鼠右踝關節(jié)明顯腫脹，造模成功。息痛散組和秋水仙堿組踝關節(jié)腫脹指數(shù)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；息痛散聯(lián)合shRNA組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠右踝關節(jié)指數(shù)比較

2.2 各組大鼠血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平比較 見表3。各組大鼠血清中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。息痛散組和秋水仙堿組大鼠血清中Cyr61、IL-1β、IL-6、TNF-α均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。息痛散聯(lián)合shRNA組與模型組血清Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6比較[pb/(n·L)]

2.3 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達比較 見表4(圖1)。干預后，模型組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達均高于正常組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。息痛散組和秋水仙堿組Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達均低于模型組Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。息痛散聯(lián)合shRNA組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表4 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達比較

圖1 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白電泳圖

2.4 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA比較 見表5。大鼠建模成功后，各組大鼠給予對應的藥物處理，觀察各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA情況。模型組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表達均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。息痛散組和秋水仙堿組Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6 的mRNA均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。息痛散聯(lián)合shRNA組各項的mRNA與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表5 各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中Cyr61、IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA比較

3 討 論

中醫(yī)學中并沒有痛風性關節(jié)炎的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬為“痹癥”“歷節(jié)”范疇[14]，《素問·痹論》曰：“風寒濕三氣雜至，合而為痹”，將痹癥分為風痹、痛痹、著痹。漢代張仲景《金匱要略》中有血痹、濕痹、歷節(jié)之名，并且創(chuàng)制了烏頭湯、桂枝芍藥知母湯。痛風最早見于南朝梁時著名醫(yī)家陶弘景的《名醫(yī)別錄·上品》，主要闡明痛風是由風邪侵襲而致。元代朱丹溪又對痛風的臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制進行具體論述，提出了多種診療方法，《格致余論·痛風論》提出：“作痛，夜則痛甚”“治法以辛熱之劑”；《丹溪心法·痛風附肢節(jié)痛》記載：“四肢百節(jié)走痛是也”。通過以上文獻的整理，筆者認為其發(fā)病機制主要與嗜食肥甘，飲酒無度，日久傷及脾胃，脾失運化，濕熱痰濁蘊積于體內，久則衍化毒熱有關，濕、熱、毒邪相互搏結，隨經外達筋骨關節(jié)，引發(fā)關節(jié)紅、腫、熱、痛等癥。因此，痰熱、濕毒壅盛為本病病機之所在，治療以祛風除濕，清熱瀉火，通絡止痛為原則。息痛散中生石膏辛甘性寒，質重降火；忍冬藤清熱解毒，宣泄風熱，活血通絡，兩者共為君藥；蒼術、黃柏以二妙組成，既可增強生石膏、忍冬藤清熱解毒之力，又可燥濕化痰；全蝎、桃仁活血通絡以止痛，為臣藥；牛膝活血通絡，引藥下行，使藥直達病所，全方共奏祛風除濕，清熱瀉火，通絡止痛之功。前期研究發(fā)現(xiàn)，息痛散可以減輕急性痛風性關節(jié)炎大鼠關節(jié)腔內尿酸鹽結晶沉積，改善急性痛風性關節(jié)炎大鼠足跖腫脹度，但炎癥因子的調控機制尚不清楚[11]。

GA炎癥的發(fā)生與IL-1β、TNF-α、IL-6密切相關。中性粒細胞異常聚集是風濕性疾病的標志。有研究表明，中性粒細胞減少可抑制關節(jié)炎癥，因此減少中性粒細胞的募集或者激活可能有助于痛風性關節(jié)炎治療[15]。在急性痛風發(fā)作期間，中性粒細胞是關節(jié)腔滲出液中的主要細胞群[16-17]，當其與尿酸鈉晶體接觸時，并產生和釋放活性形式的IL-1β[18]，導致網(wǎng)狀沉淀的形成[19]。并通過釋放TNF-α、IL-6和前列腺素E進一步激活局部炎癥反應，介導患者痛覺加重[20-22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)痛風模型大鼠滑膜組織和血清中IL-1β、TNF-α、IL-6均升高，與GA炎癥反應的特點一致，且息痛散能明顯減少GA大鼠模型機體及組織中炎癥介質釋放。

Cyr61目前被認為是一種新的促炎因子[23]。Cyr61與自身免疫性疾病的發(fā)病機制密切相關，其對免疫炎癥性疾病的影響越來越受到關注[24-25]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在類風濕關節(jié)炎中，Cyr61在關節(jié)炎癥、骨破壞的形成過程中均發(fā)揮作用[10]。本研究運用Coderre和Wall改進的方法建立急性痛風性關節(jié)炎模型，同時使用特異性Cyr61干擾慢病毒注入大鼠病變關節(jié)腔，去除滑膜中Cyr61表達，研究結果發(fā)現(xiàn)息痛散可減輕急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠關節(jié)足跖腫脹度，當Cyr61表達缺失時，息痛散抑制大鼠關節(jié)足跖腫脹度降低，同時IL-1β、TNF-α和IL-6的表達均降低。從本研究結果推測，Cyr61參與了GA的炎癥過程，能促進IL-1β、TNF-α、IL-6分泌，是GA炎癥過程的重要參與者。息痛散能明顯抑制Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA及蛋白表達，當有Cyr61慢病毒干擾時，息痛散抑制Cyr61、IL-1β、TNF-α和IL-6的能力降低，提示息痛散可能通過下調Cyr61表達來抑制急性痛風性關節(jié)炎的炎癥反應。

綜上所述，息痛散治療急性痛風性關節(jié)炎的分子生物學機制可能與降低Cyr61高表達有關，但炎癥反應的上游路線頗多，息痛散如何干預具體靶點將是本課題組下一步的主要研究方向。