武曉芬，孫睿,2

0 引言

許多前體mRNA分子經(jīng)過(guò)加工只產(chǎn)生一種成熟的mRNA，翻譯成相應(yīng)的一種多肽；有些則可剪切或（和）剪接加工成結(jié)構(gòu)有所不同的mRNA，這一現(xiàn)象稱(chēng)為可變剪接，又稱(chēng)選擇性剪接（alternative splicing,AS）[1]。

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤。盡管在過(guò)去幾十年診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但OSCC的死亡率仍然很高，迫切需要揭示OSCC的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。已有研究表明，前體mRNA的AS異常與OSCC密切相關(guān)。下面就近幾年來(lái)與OSCC相關(guān)的AS研究作一綜述，為探索OSCC靶向治療之路提供階段性借鑒。

1 OSCC中的選擇性剪接調(diào)控

AS是一個(gè)依賴(lài)于順式作用元件和反式作用因子[AS中主要為剪接因子（splicing factor,SF）]高度受控的過(guò)程。順式作用元件主要有外顯子剪接增強(qiáng)子、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子、外顯子剪接沉默子和內(nèi)含子剪接沉默子，分別促進(jìn)或抑制對(duì)特定剪接的選擇；剪接因子主要有SR（serine-arginine rich）蛋白家族和核不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP）家族，還有其他RNA結(jié)合蛋白[2]。

1.1 順式作用元件上基因多態(tài)性對(duì)剪接的影響

長(zhǎng)正五聚蛋白3（long pentraxin 3,PTX3）促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲，其2號(hào)外顯子上有定位于外顯子剪接增強(qiáng)子序列的PTX3rs3816527。經(jīng)生物信息學(xué)工具分析發(fā)現(xiàn)其C等位基因較A等位基因具更強(qiáng)的增強(qiáng)活性，可能更利于促進(jìn)PTX3基因的剪接修飾[3]。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metastasis associated with the colon cancer-1,MACC1）過(guò)表達(dá)與舌鱗癌（占OSCC的25%～40%）患者總體生存率低高度相關(guān)。位于其4號(hào)外顯子的某段序列經(jīng)分析，其上MACC1rs4721888為C等位基因時(shí)則被推定為外顯子剪接增強(qiáng)子序列，可能被人類(lèi)特異性的SR蛋白——SC35蛋白所識(shí)別[4]。至于基因多態(tài)性對(duì)OSCC的AS到底有無(wú)實(shí)質(zhì)性影響有待逐步研究。

1.2 剪接因子的過(guò)表達(dá)和調(diào)節(jié)失控

1.2.1 剪接因子的過(guò)表達(dá) 實(shí)體腫瘤中的剪接因子直接與前體mRNA結(jié)合并以濃度依賴(lài)的方式調(diào)控其下游靶點(diǎn)，故表達(dá)水平的改變會(huì)導(dǎo)致剪接失調(diào)[5]。

OSCC細(xì)胞中hnRNP A1的過(guò)表達(dá)與G2/M轉(zhuǎn)變相關(guān)聯(lián)。微陣列數(shù)據(jù)分析顯示，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)型激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）5號(hào)外顯子的AS受hnRNP A1調(diào)節(jié)，hnRNP A1敲低后CDK2亞型1（5號(hào)外顯子包含，其編碼區(qū)域位于蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中間，可能影響CDK2的功能）的表達(dá)降低[6]。RNA上的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修飾與原癌基因和腫瘤抑制基因的異常表達(dá)密切相關(guān)。與正常癌旁組織相比，OSCC組織中m6A水平顯著上調(diào)，包括hnRNP C在內(nèi)的8個(gè)發(fā)生m6A修飾的基因表達(dá)差異被鑒定出來(lái)。系列分析表明僅hnRNP C可能是OSCC中一個(gè)獨(dú)立的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[7]。與正常口腔黏膜組織相比，hnRNP L在OSCC組織中明顯過(guò)表達(dá)，主要聚集在細(xì)胞核某些區(qū)域，形成斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。與在上皮組織中不同，hnRNP L在間充質(zhì)組織中表達(dá)更多。SRSF3是hnRNP L的新靶點(diǎn)，hnRNP L可能通過(guò)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后AS兩個(gè)層面調(diào)控SRSF3的表達(dá)[8]。

SRSF3在正?？谇火つ?、口腔上皮中至重度不典型增生組織和OSCC中的表達(dá)水平逐漸增加且呈顯著差異，SRSF3可能通過(guò)調(diào)節(jié)Slug和N-鈣黏蛋白參與了OSCC的遷移過(guò)程[9]。

CUGBP胚胎致死性異常視覺(jué)樣家族成員1（CUGBP embryonic lethal abnormal vision-like family member 1,CELF1）可能是腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的潛在調(diào)控因子。利用RNA-seq技術(shù)在口腔癌細(xì)胞中鑒定出1283個(gè)由CELF1調(diào)控的與細(xì)胞增殖、血管生成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的mRNA，發(fā)現(xiàn)CELF1促進(jìn)了282個(gè)前體mRNA的選擇性剪接，其中最常見(jiàn)的剪接模式是盒式外顯子跳躍和包含，CELF1或其調(diào)控的mRNA有望成為治療性干預(yù)的候選項(xiàng)[10]。

1.2.2 剪接因子的調(diào)節(jié)失控 AS是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程，故SF本身也受到嚴(yán)格調(diào)控。自調(diào)節(jié)在SR蛋白中很常見(jiàn)。

SRSF3的4號(hào)外顯子含框內(nèi)終止密碼子，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物中若無(wú)4號(hào)外顯子，則產(chǎn)生全長(zhǎng)SRSF3；若含4號(hào)外顯子，則經(jīng)無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）或產(chǎn)生失去RS功能域的截?cái)郤RSF3。OSCC中SRSF3的過(guò)表達(dá)可致其4號(hào)外顯子的包含增加，自調(diào)節(jié)作用顯現(xiàn)。多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1/2（polypyrimidine tractbinding protein 1/2,PTBP1/2）可與4號(hào)外顯子上的外顯子剪接抑制子結(jié)合以抑制4號(hào)外顯子包含從而削弱SRSF3的自調(diào)節(jié)，SRSF3表達(dá)水平的穩(wěn)定被打破[11]。復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中單獨(dú)使用紫杉醇（Paclitaxel,PTX）時(shí)，估計(jì)有效率為40%。PTX和抗SRSF3的反義寡核苷酸——SR-3都可能通過(guò)抑制OSCC細(xì)胞中SRSF3的4號(hào)外顯子包含下調(diào)全長(zhǎng)SRSF3蛋白的表達(dá)最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故二者聯(lián)合可使OSCC患者對(duì)PTX的治療敏感，使用抗SF的反義寡核苷酸可能是一種有用的抗腫瘤新方法[12]。

SRSF5參與了細(xì)胞周期特別是S期的進(jìn)展。SRSF5的表達(dá)也受自調(diào)節(jié)機(jī)制控制，其6號(hào)外顯子存在兩個(gè)3’剪接受體位點(diǎn)，使用近端位點(diǎn)產(chǎn)生的是長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（包括一個(gè)956 bp的片段和一個(gè)框內(nèi)終止密碼子），可能編碼一個(gè)缺少RS結(jié)構(gòu)域的SRSF5蛋白，也可能通過(guò)NMD導(dǎo)致RNA降解；使用遠(yuǎn)端位點(diǎn)產(chǎn)生的是短轉(zhuǎn)錄本，編碼全長(zhǎng)的有功能的SRSF5。SRSF3過(guò)表達(dá)顯著增加了SRSF5的6號(hào)外顯子遠(yuǎn)端位點(diǎn)的使用和SRSF5蛋白的表達(dá)，也減弱了SRSF5的自調(diào)節(jié)功能[13]。

2 OSCC中的選擇性剪接事件

AS導(dǎo)致腫瘤相關(guān)剪接變體的產(chǎn)生或表達(dá)量變，這些剪接變體在OSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、抗凋亡和化療耐藥[12]方面發(fā)揮重要作用。

2.1 NOX5α

舌鱗癌中觀察到的具獨(dú)特生長(zhǎng)模式（即有顯著高度擴(kuò)張形成腫瘤塊傾向）的亞群被稱(chēng)作腫瘤起始細(xì)胞（tumor-initiating cells,TICs），高表達(dá)CD271的TICs可在放化療后持續(xù)存在。NADPH氧化酶5（NADPH oxidase 5,NOX5）是內(nèi)源性高活性氧（reactive oxygen species,ROS）的主要來(lái)源，有6個(gè)剪接變體，其中NOX5α是舌鱗癌中關(guān)鍵的ROS生成酶，NOX5α/ROS介導(dǎo)了舌鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。NOX5α的增加伴隨著CD271+細(xì)胞的增加，CD271+細(xì)胞中OCT4（干細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)水平很高，細(xì)胞成球能力（衡量腫瘤細(xì)胞干性的金標(biāo)準(zhǔn)）增強(qiáng)。NOX5α調(diào)節(jié)CD271增加后，舌鱗癌對(duì)順鉑和NK細(xì)胞的敏感度隨之降低，故靶向NOX5α活性可能有助于激活或改善口腔癌患者的NK細(xì)胞監(jiān)測(cè)程序[14]。

2.2 STAT3

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）是一種致癌基因，在細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用，通過(guò)其23號(hào)外顯子的AS產(chǎn)生兩種異構(gòu)體——STAT3α和STAT3β（不同于STAT3α，STAT3β在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮負(fù)作用），分別編碼全長(zhǎng)致癌的STAT3蛋白和截?cái)嗟鞍?。多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1（poly(rC)-binding protein1,PCBP1）為腫瘤抑制剪接因子，可通過(guò)與23號(hào)外顯子內(nèi)的外顯子剪接沉默子結(jié)合抑制近端剪接位點(diǎn)的使用促進(jìn)抑瘤型STAT3β的生成。PCBP1還可抑制由STAT3激活的抗凋亡基因如Bcl-xL和survivin的表達(dá)，故上調(diào)PCBP1的表達(dá)很可能是抑制OSCC中STAT3的有效方法[15]。

2.3 VEGF165b

血管生成與否取決于促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡變化[16]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的8號(hào)外顯子選擇近端剪接位點(diǎn)產(chǎn)生促血管亞型，如VEGF165在血管生成中發(fā)揮作用；選擇遠(yuǎn)端剪接位點(diǎn)產(chǎn)生抗血管亞型，如VEGF165b拮抗VEGF165誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。VEGF165b使成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）的黏附力更強(qiáng)，而VEGF165更能誘導(dǎo)明膠酶表達(dá)，故VEGF165b可能通過(guò)抑制明膠酶表達(dá)和激活腫瘤細(xì)胞周?chē)┫嚓P(guān)成纖維細(xì)胞（carcinomaassociated fibroblasts,CAFs）與ECM的黏附能力來(lái)促進(jìn)抗血管生成過(guò)程；VEGF165b在OSCC與CAFs邊界處的表達(dá)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，故VEGF165b陽(yáng)性染色可能更有助于監(jiān)測(cè)惡性細(xì)胞，尤其是4C/4D組織的浸潤(rùn)前端[17]。

2.4 oncTn-C

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白——細(xì)胞黏合素C（Tenascin-C,Tn-C）與腫瘤轉(zhuǎn)化進(jìn)展相關(guān)。其成熟蛋白中纖維連接蛋白Ⅲ型樣重復(fù)序列（fibronectin type Ⅲlike repeats,FNⅢ）所含的結(jié)構(gòu)域數(shù)量由AS過(guò)程確定，形成的亞型被稱(chēng)作癌胚胎Tn-C變體（oncofetal Tn-C variants,oncTn-C），致瘤性轉(zhuǎn)化過(guò)程中SRSF6參與了Tn-C的剪接。OSCC中除大量表達(dá)的幾乎含所有剪接域的大Tn-C外，還存在幾個(gè)新的Tn-C剪接變體（含F(xiàn)NⅢ中A3-A4-B結(jié)構(gòu)域，C結(jié)構(gòu)域極少表達(dá)），與惡性程度及入侵模式相關(guān)聯(lián)。這種OSCC細(xì)胞特異性的oncTn-C的合成被證明是口腔病變刷拭活檢中鑒別腫瘤細(xì)胞的一個(gè)非常好的附加標(biāo)記[18]。

2.5 FGFR1Ⅲc

促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition,EMT）的主要事件之一是來(lái)自于腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞的多種生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）將包括E盒結(jié)合鋅指蛋白1/2（Zinc finger E?box?binding homeobox 1/2,ZEB1/2）在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子激活。TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路是目前被廣泛接受的調(diào)節(jié)EMT的機(jī)制[19]。上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1和2（epithelial splicing regulatory proteins 1 and 2,ESRP1 and ESRP2）的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞上皮表型相關(guān)的AS事件，在TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中表達(dá)減少，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptor,FGFR）的異構(gòu)體轉(zhuǎn)換，使得細(xì)胞對(duì)FGF-2敏感[20]。FGFR1～FGFR4的胞外配體結(jié)合部分由三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）組成，所有FGFR基因的7號(hào)外顯子編碼Ⅲ結(jié)構(gòu)域的N端，8、9號(hào)外顯子編碼C端（分別產(chǎn)生Ⅲb和Ⅲc異構(gòu)體）。越來(lái)越多的證據(jù)表明FGFR1可能通過(guò)與FGF2相互作用在OSCC侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[21]。ZEB1/2在侵襲性癌細(xì)胞中維持高水平表達(dá)，結(jié)合至ESRP1/2的啟動(dòng)子區(qū)域抑制其轉(zhuǎn)錄。低表達(dá)ESRP1/2和高表達(dá)ZEB1/2的癌細(xì)胞與侵襲行為和不良預(yù)后相關(guān)，且只表達(dá)FGFRⅢc亞型；表達(dá)低水平ZEB1/2和高水平ESRP1/2的細(xì)胞與良好的預(yù)后相關(guān)，并呈FGFRⅢb亞型的組成性表達(dá)?？煽偨Y(jié)：（1）OSCC早期時(shí)，TGF-β逐漸積累，進(jìn)而通過(guò)誘導(dǎo)ZEB1/2的表達(dá)誘導(dǎo)EMT；（2）ZEB1/2表達(dá)增加，OSCC細(xì)胞只表達(dá)FGFR1Ⅲc，分泌的可溶性因子FGF2（FGF2 mRNA在間充質(zhì)樣細(xì)胞中高表達(dá)）激活FGFR1Ⅲc和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2），從而維持ZEB1/2的高表達(dá)；（3）因FGF2自分泌信號(hào)由TGF-β啟動(dòng)并由FGF2維持，故即使在無(wú)TGF-β的情況下，細(xì)胞也能維持EMT表型；（4）OSCC細(xì)胞間充質(zhì)表型的維持已從TGF-β信號(hào)軸轉(zhuǎn)為FGFFGFR信號(hào)軸[22]。

2.6 ΔNp63β

p 63 為p 53 的同源基因，其兩類(lèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之一ΔNp63有三種剪接變體ΔNp63α、ΔNp63β和ΔNp63γ。已證明ΔNp63β介導(dǎo)了OSCC中的EMT[23]。研究表明，一些miRNAs通過(guò)靶向EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子也參與了EMT，miR-205就可能和ΔNp63β通過(guò)調(diào)控OSCC中ZEB1/2的表達(dá)抑制EMT[24]。

2.7 ORAOV1-B

染色體11q13區(qū)域的基因被認(rèn)為在OSCC進(jìn)展特別是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？谇话┻^(guò)表達(dá)序列1（oral cancer overexpressed 1,ORAOV1），位于11q13的一個(gè)候選OSCC癌基因，其剪接變體ORAOV1-A與較差的組織學(xué)分化相關(guān)；ORAOV1-B為長(zhǎng)非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA），與OSCC轉(zhuǎn)移相關(guān)，其可直接與Hsp30結(jié)合激活NF-κB-TNFα環(huán)路以誘導(dǎo)EMT[25]。

2.8 XBP1

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中的關(guān)鍵成分即被視作標(biāo)記物的X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1,XBP1）的mRNA，在非常規(guī)剪接下得以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1。OSCC細(xì)胞中給予MG132（一種蛋白酶抑制劑，能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并部分下調(diào)XBP1的表達(dá)）的同時(shí)阻斷XBP1 mRNA的剪接，可導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)從而激活一系列促凋亡信號(hào)通路，OSCC細(xì)胞凋亡且生存途徑被阻斷。這種旨在延長(zhǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的治療方法可能是新的、有效的癌癥治療策略[26]。

3 OSCC中基于選擇性剪接的預(yù)后模型

有兩篇文獻(xiàn)基于TCGA HNSCC數(shù)據(jù)集中提取的OSCC數(shù)據(jù)識(shí)別出了與預(yù)后相關(guān)的AS事件，并開(kāi)發(fā)了OSCC的預(yù)后AS模型。一篇Zhang等[27]開(kāi)發(fā)的綜合預(yù)測(cè)模型（訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列的曲線下面積分別為0.891和0.70）具有好的敏感度和準(zhǔn)確性，在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)方面表現(xiàn)良好，對(duì)TNM分期等是很好的補(bǔ)充；OSCC中7種SF——RBM4、HNRNPD、HNRNPC、HNRNPH3、CELF2、SRP54和SRSF9與患者生存相關(guān)，SF-AS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明大多數(shù)預(yù)后不良的AS事件與SF呈正相關(guān)，SF過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)預(yù)后不良AS事件的發(fā)生。另一篇Cao等[28]開(kāi)發(fā)的模型中3年和5年總生存期的曲線下面積分別為0.83和0.82；bootstrap驗(yàn)證模型（內(nèi)部驗(yàn)證的首選方法）和5倍交叉驗(yàn)證模型中3年和5年的曲線下面積分別為0.83和0.82。依據(jù)模型，納入的患者可分作高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，研究?jī)山M患者對(duì)138種化療藥物的敏感度，發(fā)現(xiàn)3種篩選藥物（MK.2206、EHT.1864和Nutlin.3a）在低風(fēng)險(xiǎn)組中的IC50明顯降低。研究鑒定了5個(gè)與生存相關(guān)的SFs——CELF2、TIA1、HNRNPC、HNRNPK和SRSF9，機(jī)制各異。

4 總結(jié)

盡管OSCC的治療取得了顯著進(jìn)展，但其5年總生存率幾乎無(wú)變化，約為50%。OSCC中AS的調(diào)節(jié)失控和下游靶基因的表達(dá)失調(diào)提供了新的潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，基于TCGA HNSCC數(shù)據(jù)集的AS預(yù)后模型正在開(kāi)發(fā)，與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、抗凋亡和化療耐藥過(guò)程相關(guān)的選擇性剪接事件發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制，使利用反義寡核苷酸等新治療方法的探索成為可能。