陸 燕 覃小升 韋新艷

(來(lái)賓市興賓區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣西來(lái)賓市 546100)

矮身材為兒科內(nèi)分泌門(mén)診最常見(jiàn)的疾病之一，亦是近年來(lái)臨床研究的一大熱點(diǎn)。其病因機(jī)制復(fù)雜多樣，不僅可引起兒童軀體異常，還可導(dǎo)致其自信心、自尊心、認(rèn)知發(fā)育、社交能力等方面出現(xiàn)一定程度的問(wèn)題，影響兒童的身心健康[1]。因此，早期全面、準(zhǔn)確地對(duì)矮身材進(jìn)行診斷，有助于及時(shí)糾正影響兒童生長(zhǎng)的負(fù)面因素，盡早預(yù)防性用藥，使兒童盡可能達(dá)到理想身高[2]。生長(zhǎng)激素釋放肽(growth hormone-releasing peptide,Ghrelin)是作用于全身各系統(tǒng)并調(diào)控腺垂體分泌生長(zhǎng)激素的內(nèi)源性配體，其不僅能夠調(diào)控生長(zhǎng)激素的分泌，亦能夠維持能量平衡、刺激食欲、促進(jìn)胃酸分泌和胃蠕動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用[3]。有研究表明，miRNA參與人體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[4]，其中miR-125b是miRNA家族中相當(dāng)活躍的成員，目前已證實(shí)其在代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫、細(xì)胞凋亡與增殖等方面均發(fā)揮著重要作用[5-6]。然而，miR-125b、Ghrelin水平對(duì)矮身材早期診斷價(jià)值的研究仍較少。因而，本課題組分析了矮身材兒童的血清miR-125b和Ghrelin水平，并探討兩者的臨床意義，旨在為該病的臨床診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2017年8月至2020年12月收治的103例矮身材兒童作為研究組，其中男童60例、女童43例，年齡為3～7(4.57±1.11)歲，入組時(shí)身高0.78～1.10(0.92±0.09)m。另選取同期在我院體檢的100例健康兒童作為對(duì)照組，其中男童56例、女童44例，年齡為3～8(4.62±1.14)歲。兩組兒童的年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。所有監(jiān)護(hù)人均已了解本研究的大致流程及目的、內(nèi)容、獲益等，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 矮身材的診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《矮身材兒童診治指南》[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，即在相似生活環(huán)境下，同種族、同性別和同年齡的兒童身高低于健康兒童第3百分位數(shù)以下或者2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.2 研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)未伴有甲狀腺功能衰退；(2)未合并遺傳代謝病或基因異常，如特納綜合征等；(3)出生時(shí)體重正常；(4)近期無(wú)重癥感染或急性創(chuàng)傷病史；(5)經(jīng)血鈣、血磷等檢查證實(shí)無(wú)活動(dòng)期佝僂病。

1.2.3 研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)情志、飲食生活習(xí)慣不良者；(2)身材比例不協(xié)調(diào)，疑似骨骼發(fā)育異常者；(3)存在代謝性疾病及其他慢性疾病引起的生長(zhǎng)遲緩者；(4)入組前3個(gè)月內(nèi)曾經(jīng)接受過(guò)糖皮質(zhì)激素、生長(zhǎng)激素治療者；(5)存在重要臟器疾病者。

1.3 一般資料的收集 收集并記錄患兒入組時(shí)的年齡、性別、身高、體重，以及患兒父母的身高。計(jì)算體質(zhì)指數(shù)和靶身高。體質(zhì)指數(shù)=體重(kg)/身高2(m2)。靶身高計(jì)算公式：男童身高=[父親身高(cm)+母親身高(cm)+13 cm]÷2，女童身高=[父親身高(cm)+母親身高(cm)-13 cm]÷2。

1.4 治療方法 所有矮身材患兒均接受生長(zhǎng)激素治療[8]，即給予重組人生長(zhǎng)激素注射液(長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：30 IU/10 mg；批號(hào)：20170929；國(guó)藥準(zhǔn)字S20050025)0.15～0.20 IU/(kg·d)，每晚睡前半小時(shí)皮下注射，均連續(xù)治療6個(gè)月。

1.5 骨齡測(cè)定 入組時(shí)拍攝左手正位+腕部X線(xiàn)片。根據(jù)X線(xiàn)片圖像，運(yùn)用《中國(guó)青少年兒童手腕骨成熟度及評(píng)價(jià)方法》[9]評(píng)估患兒的骨齡，并計(jì)算年齡與骨齡的差值，表示為年齡-骨齡。

1.6 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測(cè)

1.6.1 標(biāo)本采集：研究組患兒于入院24 h內(nèi)、治療3個(gè)月和6個(gè)月后，對(duì)照組兒童于體檢當(dāng)日，抽取清晨空腹靜脈血10 mL，分置兩管，于室溫保存。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-125b表達(dá)水平：取其中一管血液標(biāo)本，采用TRIzolTM試劑[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，貨號(hào)：15596026)]提取標(biāo)本血清RNA，微量核酸定量Qubit Flex 熒光計(jì)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]測(cè)定A260、A280值，并計(jì)算總RNA濃度，所提取的總RNA質(zhì)量(A260/A280比值在1.8～2.2之間)和濃度(20 ng/μL以上)均符合PCR反應(yīng)要求，隨后于-80 ℃凍存，所有樣本均于1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號(hào)：LM-266)說(shuō)明書(shū)，取2 μL RNA溶液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA模板。采用Primer軟件設(shè)計(jì)引物，miR-125b上游引物序列為T(mén)CCCACGTGACGACGTCTAT，下游引物序列為T(mén)CGAGTCATGTTCACCGGACTG；U6(內(nèi)參)上游引物序列為CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列為AACGCTTCACGAATTTGCGT。PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括Taq DNA聚合酶0.2 μL、Mg2+2.0 μL、模板DNA 0.2 μg、dNTPs 2 μL、引物0.5 μL，加雙蒸水或三蒸水至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。在60 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，記錄Ct值，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平。為避免因各樣本總RNA濃度的不同或是其他不可控因素導(dǎo)致的誤差，同一條件檢測(cè)3次，取其平均值。

1.6.3 ELISA檢測(cè)血清Ghrelin水平：取另外一管血液標(biāo)本，采用離心機(jī)低速離心(離心速度為3 500 r/mim，離心半徑為8 cm，溫度為4 ℃)20 min后獲取血清，使用ELISA試劑盒(上海語(yǔ)純生物科技有限公司，批號(hào)：20170712)檢測(cè)血清Ghrelin水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量計(jì)量資料的比較采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析性，使用Logistic回歸模型分析血清學(xué)指標(biāo)與兒童矮身材的相關(guān)性。以P<0.05為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平的比較 研究組治療前的血清miR-125b表達(dá)水平及Ghrelin水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平比較(x±s)

2.2 血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平與兒童矮身材的相關(guān)性 以是否出現(xiàn)矮身材作為因變量，選取現(xiàn)研究認(rèn)為可能與兒童矮身材相關(guān)的因素(靶身高、父親身高、母親身高、年齡-骨齡)、血清miR-125b表達(dá)水平、血清Ghrelin水平作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。變量賦值見(jiàn)表2。在校正相關(guān)因素后，血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平均與兒童矮身材相關(guān)(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 變量賦值表

表3 Logistic回歸分析結(jié)果

2.3 矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平與治療效果的關(guān)系 矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平均隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而降低(均P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 治療前后矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平的變化(x±s)

3 討 論

目前疾病監(jiān)測(cè)手段不斷更新，更多的生物標(biāo)志物應(yīng)運(yùn)而生。作為結(jié)構(gòu)和功能較為明確的內(nèi)源性配體，Ghrelin在人體生長(zhǎng)發(fā)育中的作用得到諸多研究者的關(guān)注[10-11]。國(guó)外學(xué)者M(jìn)aldonado-Ruiz等[12]通過(guò)一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，孕期母體營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩可出現(xiàn)Ghrelin高表達(dá)，而通過(guò)藥物治療抑制Ghrelin表達(dá)能夠有效改善大鼠后代肥胖、貪食等表現(xiàn)及機(jī)體炎癥水平。Yokota-Nakagi等[13]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)下調(diào)Ghrelin及其受體的表達(dá)來(lái)抑制Ghrelin的促食欲作用，可緩解去卵巢肥胖大鼠的能量攝入紊亂和體重超標(biāo)等情況。此外，有學(xué)者通過(guò)觀察不同病因矮小癥兒童在生長(zhǎng)激素治療前后的Ghrelin水平發(fā)現(xiàn)，矮小癥患兒可能存在Ghrelin抵抗，血清Ghrelin水平有助于評(píng)估矮小癥患兒治療期間的生長(zhǎng)情況[14]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的最新臨床試驗(yàn)研究[15-16]同樣也支持這一結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，矮身材兒童治療前的血清Ghrelin水平高于健康兒童，且Logistic回歸分析結(jié)果提示血清Ghrelin水平升高與兒童矮身材相關(guān)(P<0.05)，與解欣等[17]的研究相似。Ghrelin不僅可通過(guò)不同的方式調(diào)控生長(zhǎng)激素-胰島素軸，還能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和功能，誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞的增殖及分化，進(jìn)一步調(diào)節(jié)骨骼代謝與機(jī)體能量代謝，從而影響骨骼的生長(zhǎng)狀態(tài)，因此推測(cè)抑制Ghrelin活化可調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡、調(diào)控骨發(fā)育等[18]。由此可見(jiàn)，矮身材兒童體內(nèi)Ghrelin呈反饋性增高，從而在促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。

人的生長(zhǎng)和最終身高亦受到遺傳因素的影響，而表觀遺傳調(diào)控機(jī)制涉及DNA甲基化、組蛋白修飾及miRNA[19]。miRNA是一種高度保守的、長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，其主要通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，以激活下游的靶因子，從而調(diào)控細(xì)胞的病理過(guò)程[20]。miRNA參與多個(gè)生命過(guò)程，其中miR-125b在內(nèi)分泌疾病的發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用已逐漸得到關(guān)注。唐家彥等[21]發(fā)現(xiàn)，中樞性性早熟女童的血清miR-125b表達(dá)水平升高，是下丘腦-垂體-性腺軸過(guò)早激活的可能作用機(jī)制。此外，郭東光等[22]發(fā)現(xiàn)，miR-125b與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育功能相關(guān)，而Ghrelin可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖和分化；這一發(fā)現(xiàn)亦證實(shí)了細(xì)胞增殖分化過(guò)程中Ghrelin與miR-125b存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，后者可能是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育的重要潛在靶基因。本研究結(jié)果顯示，矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平高于健康兒童，且Logistic回歸分析結(jié)果提示血清miR-125b表達(dá)水平升高與兒童矮身材相關(guān)(P<0.05)，這符合矮身材的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制，表明miR-125b參與矮身材兒童的生長(zhǎng)發(fā)育。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平均降低(P<0.05)，即隨著治療藥物起效，矮身材兒童的生長(zhǎng)發(fā)育趨于正常后，其體內(nèi)的miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平也隨之下調(diào)。這也間接表明，監(jiān)測(cè)血清miR-125b和Ghrelin水平有助于判斷病情的發(fā)展和預(yù)后，從而及時(shí)調(diào)整矮身材兒童的治療方案。

綜上所述，矮身材兒童血清miR-125b表達(dá)水平和Ghrelin水平均升高，兩者在促進(jìn)矮身材兒童生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，且有助于評(píng)估矮身材兒童的治療效果。但本研究樣本量相對(duì)較小，這可能對(duì)結(jié)果可信度造成一定影響。因此今后仍需開(kāi)展大樣本、多中心的臨床研究對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步論證。