楊 蕾

（首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院，北京 100038）

少陽感冒顆粒是由柴胡、黃芩、人參、甘草、半夏、干姜、大棗和青蒿8味藥材組成，具有解表散熱，和解少陽之功效。常用于外感病邪犯少陽證，癥見寒熱往來、胸脅苦滿、食欲不振、心煩喜嘔、口苦咽干等癥[1]。方中柴胡具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣等功效，其中柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分[2]；黃芩具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效，黃酮類物質(zhì)是黃芩中重要活性成分[3]；人參具有大補元氣，復(fù)脈固脫，補脾益肺等功效，人參皂苷是人參中重要的活性物質(zhì)，因此人參皂苷的含量是評價人參內(nèi)在質(zhì)量的重要指標之一[4]；甘草是一味應(yīng)用極廣的藥材，具有補脾和胃，調(diào)和諸藥等功效，有效成分包括黃酮類、三萜類和多糖類物質(zhì)[5]；干姜是常用的藥食同源中藥材，以6-姜辣素為代表的姜辣素類物質(zhì)具有性熱味辛，溫中散寒，回陽通脈，溫肺化飲等功效[6]。少陽感冒顆?，F(xiàn)行標準僅對黃芩苷含量進行控制，目前對該品種其他成分含量測定報道較少[1,7]。為更全面、客觀地反應(yīng)該品種質(zhì)量，本研究基于2020年版《中國藥典》一部中上述5味藥材含量測定項下的指標成分，結(jié)合各成分的提取率、穩(wěn)定性等，確定以黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d作為少陽感冒顆粒的指標成分，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測（HPLC-DAD）同時測定上述8個成分含量，以期提供多指標評價該制劑質(zhì)量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（配置DAD 檢測器，美國安捷倫公司）；XPE-205電子分析天平（d=0.001 mg，瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-100VDB 三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

8批少陽感冒顆粒（吉林長白山藥業(yè)集團股份有限公司，批號：20201123，20210308，20210107，20201212；廣東在田藥業(yè)有限公司，批號：200911，201204，210122，210223，規(guī)格均為8 g/袋）；黃芩苷對照品（批號：110715-201821，含量：95.4 %），甘草苷對照品（批號：111610-201908，含量：95.0 %），甘草酸銨對照品（批號：110731-202021，含量：96.2 %），人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-202034，含量：94.0 %），人參皂苷Re對照品（批號：110754-202028，含量：93.9 %），6-姜辣素對照品（批號：111833-202007，含量：99.3 %），柴胡皂苷a對照品（批號：110777-201912，含量：94.8 %），柴胡皂苷d對照品（批號：110778-201912，含量：96.3 %）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈，甲醇均為色譜純（美國默克公司）；其余試劑為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8-9]

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.2 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9 min，10 %A；9～23 min，10 %→23 %A；23～40 min，23 %→45 %A；40～51 min，45 %→30 %A；51～60 min，30 %→10 %A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：1～7 min為280 nm（檢測黃芩苷），7～20 min為237 nm（檢測甘草苷），20～26 min為210 nm（檢測人參皂苷Rg1、人參皂苷Re），26～30 min為237 nm（檢測甘草酸銨），30～45 min為280 nm（檢測6-姜辣素），45～60 min為210 nm（檢測柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl；運行時間：60 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品各適量，精密稱定，加70 %甲醇溶液溶解并稀釋制成每1 ml含黃芩苷1512.4 μg、甘草苷604.8 μg、甘草酸銨901.6 μg、人參皂苷Rg1401.7 μg 、人參皂苷Re 455.6 μg、6-姜辣素700.5 μg、柴胡皂苷a 856.5 μg和柴胡皂苷d 120.9 μg的混合對照品儲備液，精密量取上述儲備液2 ml，置100 ml量瓶中，用70 %甲醇溶液稀釋至刻度，即得。

2.2.2 供試品溶液[1,10]取樣品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70 % 甲醇溶液100 ml，密塞，稱定重量，回流30 min，放冷，再稱定重量，用70 %甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例制備缺柴胡、黃芩、人參、甘草和干姜的陰性樣品，并按2.2.2項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，供試品溶液的色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時間的色譜峰，且黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰與相鄰色譜峰分離度良好；陰性對照溶液在各保留時間處無干擾。

圖1 HPLC圖譜

2.4 線性關(guān)系考察

取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，分別進樣5，10，20，50，100 μl，測定；以黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的進樣量（X，μg）為橫坐標，色譜峰的峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，計算回歸方程，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，混合對照品溶液中8種成分在其對應(yīng)的進樣量范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表1 8個成分的線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗

取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算8個活性成分的峰面積RSD值。結(jié)果得黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積RSD分別為1.52 %，0.74 %，1.23 %，1.15 %，0.66 %，1.26 %，0.91 %，0.70 %（n=6），表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取2.2.2項下供試品溶液（批號：20201123），分別于室溫放置0，2，4，8，16，24 h后，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積的RSD分別為1.74 %，0.98 %，0.83 %，1.38 %，1.22 %，1.04 %，0.76 %，1.24 %（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：20201123）適量，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的平均含量分別為5.7634，2.3703，3.6514，1.5292，1.8609，2.8285，3.4146，0.4463 mg/g，RSD分別1.01 %，0.96 %，0.83 %，1.25 %，1.78 %，1.43 %，1.82 %，0.90 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗

取樣品約0.25 g，共6份（批號：20201123），精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入2.2.1項下混合對照品儲備液1 ml，按2.2.2項下方法制備加樣回收供試品溶液，并按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d平均回收率分別為99.1 %，99.0 %，100.7 %，98.7 %，101.1 %，100.6 %，101.6 %，98.8 %，RSD分別為1.10 %，1.05 %，0.38 %，0.70 %，1.24 %，1.01 %，0.55 %，1.57 %，見表2。結(jié)果表明，方法準確性良好。

表2 加樣回收試驗結(jié)果

表2 （續(xù)）

2.9 樣品含量測定

取8批樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，結(jié)果見表3。8批樣品中黃芩苷含量均最高，柴胡皂苷d含量均最低；同一生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的樣品中同一成分含量差異較小，不同廠家之間同一成分含量差異較大。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 波長的選擇[1,11-13]

采用DAD檢測器，在200～400 nm波長范圍內(nèi)對2.2.1項下混合對照品溶液進行掃描。結(jié)果，黃芩苷在281 nm波長處有最大吸收，甘草苷和甘草酸銨分別在237 nm、239 nm波長處有最大吸收，6-姜辣素在278 nm波長處有最大吸收，人參皂苷Rg1和人參皂苷Re在204 nm波長處有最大吸收，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分別在209 nm和210nm波長處有最大吸收，人參皂苷Rg1和人參皂苷Re在最大吸收波長處測定的響應(yīng)值與210 nm波長處測定的響應(yīng)值差異不大。為減少頻繁切換波長對基線造成的干擾，參考2020版《中國藥典》一部黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的檢測波長，結(jié)合8種成分的出峰順序及色譜峰強度，最終確定在280 nm波長處檢測黃芩苷和6-姜辣素、237 nm波長處檢測甘草苷和甘草酸銨、210 nm波長處檢測人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d。試驗采用波長切換法，既保證了各成分良好響應(yīng)，也減少了檢測器頻繁切換對基線噪音的影響。

3.2 提取方法的選擇

分別考察了70 %乙醇溶液、50 %甲醇溶液、70 %甲醇溶液和甲醇的提取效果。以70 %乙醇溶液作為提取溶劑時，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和6-姜辣素色譜峰出現(xiàn)拖尾；用50 %甲醇溶液提取時，提取不完全；70 %甲醇溶液和甲醇作為提取溶劑時8個成分提取完全，無拖尾現(xiàn)象，甲醇提取雜質(zhì)峰稍多，出現(xiàn)主峰與相鄰色譜峰不能完全分離的情況，故采用70 %甲醇溶液作為提取溶劑。在此基礎(chǔ)上，分別考察了超聲和回流兩種提取方式及不同提取時間對各成分提取率的影響。綜合考慮各主峰的峰型、峰面積、分離度等因素。最終確定以70 %甲醇為提取溶劑，回流提取30 min作為供試品溶液的制備方法。

3.3 流動相的選擇

在參考相關(guān)方法的基礎(chǔ)上[14-16]，分別考察甲醇、乙腈有機相對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇的洗脫能力優(yōu)于乙腈；少陽感冒顆粒成分復(fù)雜多樣，等度洗脫難以完全分離8個成分，最終確定以甲醇-0.2 %磷酸水溶液為流動相，按2.1項下方法梯度洗脫，能使待測組分得到很好分離。

綜上，本文建立的HPLC-DAD法同時測定少陽感冒顆粒中黃芩苷、甘草苷、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，比現(xiàn)行標準更能全面、準確地反映藥品質(zhì)量，可為該制劑的質(zhì)量標準提升提供方法學參考。