祁佳佳，楊嘉怡，范亞夢，李典鵬，王先友*

(1.河南大學(xué) 藥學(xué)院,河南 開封 475004； 2.廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西 桂林 541006)

大果山楂為薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物臺灣林檎[Malusdoumeri(Bois)Chev.]和光萼林檎(MalusleiocalycaS.Z.Huang)的成熟果實[1],主要來源于臺灣林檎,它又名烏嬋子(廣西苗語)、麻缺頓、撒多、廣山楂(商品名)等。主要分布于云南富寧、西疇和廣西德保、靖西、那坡，廣西東蘭及天峨也有少量引種[2]。大果山楂性味甘、酸、澀、味溫，與我國傳統(tǒng)中藥山楂(北山楂)有相似的成分和功效[3]，富含營養(yǎng)，包括豐富的氨基酸、維生素、鞣質(zhì)、多酚、微量元素、黃酮類、熊果酸和單寧等[4]。具有理氣健脾、消食導(dǎo)滯、預(yù)防腫瘤、降壓、抑菌、抑制自由基、抗氧化和提高免疫力等保健功效。其果皮青黃色，果肉白色，肉質(zhì)細嫩，果實大且肉厚，氣味清香。鮮食酸澀，現(xiàn)主要被加工成山楂粉、干片、果脯、醋、山楂酒、茶等系列食品[3]。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，是人體不可缺少的物質(zhì)。由蛋白質(zhì)水解所得到的α-氨基酸共有20多種[5]，α-氨基酸一般能溶于酸性或堿性水溶液中，但難溶于極性小的有機溶劑。因此采用合適的方法完全提取氨基酸，對后續(xù)含量測定很重要。

大果山楂富含氨基酸、黃酮類和三萜類等藥物成分，具有降壓和顯著擴張血管的作用，能增加心肌收縮力、抗心律不齊、降低甘油三酯和膽固醇[6-7]。目前對大果山楂的活性成分和藥理作用、工藝研究等方向研究較多[8-9]，對大果山楂氨基酸含量測定較少。因此，本實驗對大果山楂中苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸和亮氨酸的含量進行分析研究，為大果山楂的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試劑及材料

1.1 儀器

HPLC色譜儀(日本島津，LC-20A)；紫外檢測器(日本島津，SPD-20A)；色譜柱(Agilent公司，Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；電子分析天平(ESJ200-4B，沈陽龍騰電子有限公司)。

1.2 試劑

苯丙氨酸，組氨酸，酪氨酸，亮氨酸(含量98%，供含量測定用，阿拉丁)。甲醇(色譜純，科密歐)，其余試劑均為分析純。

1.3 材料

大果山楂果實采自廣西靖西,經(jīng)廣西植物所李典鵬研究員鑒定為蘋果屬大果山楂[Malusdoumeri(Bois)Chev.]的果實，干燥后粉碎，過40目篩。

2 方法與結(jié)果2.1 溶液的配制2.1.1 對照品儲備溶液

精密稱取苯丙氨酸、組氨酸、酪氨酸對照品各約0.01 g，亮氨酸0.02 g分別置于4個10 mL量瓶中，均用蒸餾水定容，搖勻，得對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液

在確定氨基酸的提取條件時，參考了多篇關(guān)于氨基酸含量測定條件篩選的文獻[10-16]。最終確定條件為：精密稱取大果山楂干燥粉末約1 g，置于250 mL燒瓶內(nèi)，加7 mol/L鹽酸溶液50 mL，回流提取6 h，冷卻至室溫，抽濾，濾液減壓濃縮至干燥，揮去HCl[16]，使溶液pH>3。用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，即得生藥為100 g /L的樣品溶液。微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm),室溫；流動相為甲醇∶水(體積比為3∶97)，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.0，流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長：205 nm。

2.3 方法學(xué)考察2.3.1 系統(tǒng)精密度試驗

分別用一定濃度的各氨基酸對照品溶液，按照“2.2色譜條件”重復(fù)進樣6次，測得酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸峰面積的RSD分別為1.6%、1.1%、0.1%和1.6%，結(jié)果表明系統(tǒng)精密度較好。

2.3.2 重復(fù)性試驗

按照“2.1.2”項下內(nèi)容操作，平行6份。以“2.2”中的色譜條件檢測，測得酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸含量的RSD分別為1.7%、1.4%、1.3%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

按照“2.2”色譜條件，得到實驗結(jié)果如下：供試品溶液中組氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的理論塔板數(shù)均≥2 600，分離度均>1.5，實驗結(jié)果表明系統(tǒng)適用性良好，可用于檢測。色譜圖如圖1和2所示。

圖1 大果山楂對照品的色譜圖

圖2 大果山楂供試品的色譜圖

2.3.4 線性范圍考察

將“2.1.1”中配制好的各有機酸對照品儲備液進行稀釋，得到濃度如下的各溶液：酪氨酸：0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L；亮氨酸：0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L；苯丙氨酸溶液：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L；組氨酸：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L。按照“2.2”項下色譜條件檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，得回歸分析方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.3.5 回收率試驗

稱取6份已知各成分含量的大果山楂樣品適量，分別精密加入適量的各氨基酸對照品，按照“2.1.2”中的方法操作，按照“2.2”中的色譜條件進行檢測。各成分的加樣回收率見表2。

表2 回收率結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

按照上述條件進行測定，以外標(biāo)對照法計算，各種氨基酸的含量結(jié)果見表3。

表3 氨基酸的含量

3 討論

目前，大多數(shù)文獻報道氨基酸的提取采用超聲醇提[12]、水提[12-13]和酸提[14-15,17]。按照朱福灼等用75%乙醇溶液冷凝回流提取2 h實驗[12],結(jié)果出峰效果不好。參考許慧等對鹿茸藥材中14種氨基酸的含量測定的研究[14]及蘇雅拉圖等人對蓖麻餅粕提取氨基酸及酸水解法優(yōu)化初探的實驗結(jié)果[15]，結(jié)合本產(chǎn)品特征和儀器性能建立了大果山楂中氨基酸的提取方法。然而據(jù)目前的文獻報道，山楂中的酪氨酸含量大于亮氨酸的含量[9-10]，本實驗所得結(jié)果與之相反。是否由于提取方法不同，或是生長環(huán)境和品種不同所致，尚待進一步研究。

4 結(jié)論

本實驗建立了大果山楂中氨基酸提取方法：采用7 mol/L鹽酸冷凝回流6 h提取大果山楂中的氨基酸；采用靈敏度和準(zhǔn)確度較好的高效液相色譜法測定了大果山楂中氨基酸的含量。研究結(jié)果表明，色譜條件簡單易行，儀器精密度和回收率高，重現(xiàn)性好，表明此實驗方法可行。