王苗苗，孫瑞芬，王均亮，李趙菊，張 婷，周旭紅*

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 科技處科研實(shí)驗(yàn)中心，云南 昆明 650500)

石竹為石竹科石竹屬植物，多年生草本。石竹屬DianthusL.植物全球約600種，廣泛分布于北溫帶，大部分產(chǎn)于歐洲和亞洲。我國(guó)有16種10變種，南北均產(chǎn)之，大多生于干燥向陽(yáng)處?，F(xiàn)已廣泛栽培，是很好的觀賞花卉，耐瓶插，常用作切花[1]。同時(shí)石竹屬植物也具有很好的藥用價(jià)值。因此，研究其植物活性成分的含量具有重要意義，可以為石竹屬植物提供更為廣闊的市場(chǎng)前景。

香石竹DianthuscaryophyllusL.具有清熱利尿、破血、通便的功效，其花可用作芳香矯味劑、解痙劑、鎮(zhèn)靜劑[2]。在過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間里，香石竹被用于愈合傷口，治療咽喉和牙齦感染，胃腸道疾病以及其他各種疾病。中藥瞿麥來(lái)源于石竹屬植物瞿麥DianthussuperbusL. 或石竹DianthuschinensisL. 的干燥地上部分，具有利尿通淋、活血通經(jīng)的功效。用于熱淋、血淋、小便不通、經(jīng)閉瘀阻等癥[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石竹還具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌和殺蟲等作用[4-8]。

山奈酚三糖苷是石竹的活性成分之一，屬于黃酮醇類化合物。在植物中，黃酮醇的作用是保護(hù)植物抵抗環(huán)境的各種刺激。在人體中，黃酮醇對(duì)人體的生物反應(yīng)起修飾作用，具有廣泛的藥理作用。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚三糖苷可能對(duì)小鼠燒傷有療效。用主要含有山奈酚三糖苷成分的山茶花提取物對(duì)燒傷小鼠進(jìn)行治療，可以降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平并增加膠原合成?？赡芡ㄟ^(guò)抑制 NF-κB信號(hào)通路降低 LPS刺激的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平。因此，山奈酚三糖苷是治療人類燒傷的有效、安全的潛在藥物。Shkondrov等[10]在6-羥多巴胺誘導(dǎo)的離體大鼠腦突觸體體外模型上發(fā)現(xiàn)山奈酚三糖苷具有與水飛薊素相似的神經(jīng)保護(hù)活性, 具有神經(jīng)退行性疾病治療作用。但目前對(duì)不同品種石竹中山奈酚三糖苷含量的分析評(píng)價(jià)研究尚少。

參考文獻(xiàn)[11-13]，建立合適的石竹植物中山奈酚三糖苷的含量測(cè)定方法，并使用所建HPLC法對(duì)云南省玉溪市江川區(qū)石竹種植基地采集的16種石竹以及石竹不同部位進(jìn)行山奈酚三糖苷成分的含量測(cè)定，通過(guò)比較不同品種、不同部位的含量差異，為培育或采收合適的品種、植物的不同組織提供參考依據(jù)。為進(jìn)一步開發(fā)利用石竹植物資源提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀(包括DAD 檢測(cè)器,美國(guó) Agilent 公司)；電子天平EX125DZH(奧豪斯儀器有限公司)；超聲波清洗器SG3300HDT(上海冠特超聲儀器有限公司)；醫(yī)用離心機(jī)L550(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)材料

山奈酚三糖苷(Kaempferol-3-O-(2”-glucosyl)rutinoside)對(duì)照品(云南西力生物技術(shù)有限公司，純度≥98%)；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸、冰乙酸等化學(xué)試劑為分析純。石竹16個(gè)不同品種見圖1以及‘BRINA’花的不同發(fā)育時(shí)期見圖2，均采自云南省玉溪市江川區(qū)石竹種植基地，具體信息見表1。

表1 石竹的不同品種信息

A,RW; B,YF; C,狂歡; D,Miss Vanilla; E,紫羅蘭;F,云彤;G,羅西奧; H,MOON GOLEM; I,GF; J,TONIC GOLEM;K,MUTP9;L,BRINA;M,瞿麥;N,云紫云;O,云粉暈;P,云蝶花

圖2 ‘BRINA’花的不同發(fā)育時(shí)期

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 色譜條件

經(jīng)查閱并參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，最終確定的色譜條件如下：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)柱；流動(dòng)相：A相：1.5%磷酸、40%乙腈、50%冰乙酸，B相：1.5%磷酸水溶液，洗脫條件：A相從10%～40%進(jìn)行梯度洗脫，共30 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取山奈酚三糖苷對(duì)照品20 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成濃度為2 g/L的對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

取石竹的新鮮花瓣，用液氮冷凍干燥并迅速研磨粉碎，精密稱取2.0 g放入10 mL溶劑(甲醇90%：冰乙酸10%)中，搖勻，室溫浸提48 h后，補(bǔ)重，離心，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.3.4 專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液(甲醇90%：冰乙酸10%)，按‘1.3.1’項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取2 g/L的對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成系列不同濃度的對(duì)照品溶液，按‘1.3.1’項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.4 方法學(xué)考察試驗(yàn)1.4.1 精密度試驗(yàn)

取0.5 g/L對(duì)照品溶液適量，按‘1.3.1’項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取石竹花‘BRINA’供試品溶液適量，按‘1.3.1’項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，合計(jì)考察8次記錄峰面積的值。并根據(jù)峰面積計(jì)算出RSD值。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精確稱取‘BRINA’供試品2.0 g共6份，按‘1.3.3’項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按‘1.3.1’項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出相關(guān)的RSD值。

1.4.4 加樣回收率試驗(yàn)

共取9份新鮮‘BRINA’供試品，每份精密稱取1.0 g，每3份為一組，每組分別根據(jù)樣品中所含目標(biāo)成分含量的50%、100%、150%精密添加低、中、高3個(gè)水平的對(duì)照品，按‘1.3.3’項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按‘1.3.1’項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD值。

1.5 石竹中山奈酚三糖苷的含量測(cè)定1.5.1 石竹不同品種山奈酚三糖苷含量測(cè)定

精密稱取16種不同石竹鮮花樣品，按‘1.3.3’項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按‘1.3.1’項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積的值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到山奈酚三糖苷的含量。

1.5.2 ‘BRINA’花不同發(fā)育時(shí)期山奈酚三糖苷含量測(cè)定

精密稱取‘BRINA’樣品不同發(fā)育時(shí)期各3份，按‘1.3.3’項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按‘1.3.1’項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積的值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到山奈酚三糖苷的含量。

1.5.3 ‘BRINA’不同部位山奈酚三糖苷含量測(cè)定

精密稱取‘BRINA’樣品花瓣、花萼、葉、莖不同部位各3份，按‘1.3.3’項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按‘1.3.1’項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積的值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到山奈酚三糖苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察結(jié)果

按‘1.3.4’測(cè)得的HPLC色譜圖見圖3。由圖3可知，在相同的保留時(shí)間對(duì)照品和供試品均有峰出現(xiàn)，且空白對(duì)照溶液對(duì)山奈酚三糖苷的測(cè)定沒有干擾。

A,對(duì)照品溶液; B,石竹樣品溶液; C,空白對(duì)照溶液; D,對(duì)照品與樣品疊加圖

2.2 山奈酚三糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照‘1.3.5’試驗(yàn)方法，以對(duì)照品溶液的濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。并繪制出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，得出回歸方程：山奈酚三糖苷為y=16 840.332 00x+84.737 89，R2=0.999 95，表明對(duì)照品在0.063～2.000 g/L的濃度范圍內(nèi)顯示出良好的線性關(guān)系。

圖4 山奈酚三糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 山奈酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)結(jié)果

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果2.3.1 精密度試驗(yàn)

連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出RSD值為0.48%,見表3。RSD<2%，表明儀器精密度良好。

表3 山奈酚三糖苷的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)8次不同時(shí)間進(jìn)樣的峰面積計(jì)算出RSD值為1.36%，見表4。RSD<2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 山奈酚三糖苷穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)6份相同處理方法的供試品的數(shù)據(jù)，計(jì)算出相關(guān)的RSD值為1.29%，見表5。RSD<2%，表明該方法重復(fù)性良好。

表5 山奈酚三糖苷的重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

根據(jù)峰面積，分別計(jì)算1∶0.5、1∶1、1∶1.5三組的加樣回收率為101.22%、102.20%和101.24%，RSD值為0.55%，結(jié)果見表6。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果表明RSD<2%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

表6 山奈酚三糖苷加樣回收率測(cè)試結(jié)果

2.4 石竹中山奈酚三糖苷的含量測(cè)定結(jié)果2.4.1不同品種的含量測(cè)定

根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出各個(gè)供試品的含量，結(jié)果見表7和圖5。其中，用abcd等小寫字母標(biāo)注顯著性差異的方法：首先將全部平均數(shù)從大到小依次排列，然后在最大的平均數(shù)上標(biāo)上字母a；并將該平均數(shù)與以下各平均數(shù)相比，凡相差不顯著的，都標(biāo)上字母a，直至某一個(gè)與之相差顯著的平均數(shù)，標(biāo)記字母b；再以該標(biāo)有b的該平均數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，與上方各個(gè)比它大的平均數(shù)比較，凡不顯著的也一律標(biāo)以字母b；再以標(biāo)有b的最大平均數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，與以下各未標(biāo)記的平均數(shù)比，凡不顯著的繼續(xù)標(biāo)以字母b，直至遇到某一個(gè)與其差異顯著的平均數(shù)標(biāo)記c,以此類推。從圖5和表7可以看出，以‘云粉暈’樣品中山奈酚三糖苷成分的含量最高為3.866 mg/g，‘瞿麥’的含量次之為3.169 mg/g，“狂歡”的含量最低為0.274 mg/g。‘云粉暈’、‘瞿麥’、‘紫羅蘭’、‘GF’、‘BRINA’5個(gè)品種的含量顯著高于其他11個(gè)品種。

表7 不同品種花中山奈酚三糖苷的含量測(cè)定(n=3)

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖中相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.4.2 ‘BRINA’花不同發(fā)育時(shí)期的含量測(cè)定

根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出各個(gè)供試品的含量，結(jié)果見表8和圖6(A)。BRINA-花蕾期(2～2.5 cm)含量最高，BRINA-初開期(3～4 cm)含量最低，可以看出隨著花的開放程度，山奈酚三糖苷的含量呈下降趨勢(shì)。

表8 ‘BRINA’不同時(shí)期的山奈酚三糖苷的含量測(cè)定(n=3)

2.4.3 ‘BRINA’不同部位的含量測(cè)定

根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出各個(gè)供試品的含量，結(jié)果見表9和圖6(B)，花瓣>花萼>葉>莖，花瓣的含量最高，莖含量最低。

表9 ‘BRINA’不同部位的山奈酚三糖苷的含量測(cè)定(n=3)

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖中相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法及色譜條件的篩選

采用HPLC法測(cè)定了不同石竹植物中的山奈酚三糖苷的含量。供試品溶液制備考察了浸提法、超聲提取法對(duì)含量的影響，最后確定為浸提法，操作簡(jiǎn)單，耗能少，且提取率較高。全波長(zhǎng)掃描顯示267 nm處有最大吸收峰，柱溫在30 ℃時(shí)分離效果較好且節(jié)能，通過(guò)參考文獻(xiàn)[11-13]及多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，最后確定的色譜條件為：A通道流動(dòng)相：1.5%磷酸、40%乙腈、50%冰乙酸，B通道流動(dòng)相：1.5%磷酸水溶液，A通道從10%～40%進(jìn)行梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm, 柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。方法學(xué)考察結(jié)果表明所用方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、待測(cè)成分不受干擾，可用于石竹中山奈酚三糖苷的含量測(cè)定。

3.2 指標(biāo)成分的選擇

山奈酚三糖苷是石竹的活性成分之一[14]，屬于黃酮醇類化合物。黃酮醇是植物中含量最豐富的類黃酮，通常以單核、二糖苷、三糖苷的形式出現(xiàn)[15]。作為重要的次生代謝物質(zhì)，黃酮醇廣泛存在于植物各種組織及不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育以及植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫反應(yīng)[16]。另外，黃酮醇對(duì)人體也有很大的益處，具有抗過(guò)敏、抗炎、抗腫瘤等功能。其化學(xué)成分含量及藥理活性的研究，可以為含有黃酮醇類的植物提供更高的價(jià)值。

3.3 不同石竹中山奈酚三糖苷含量的差異

利用該方法測(cè)定并比較了不同品種石竹花中山奈酚三糖苷的含量，測(cè)定結(jié)果顯示石竹16個(gè)品種中均含有山奈酚三糖苷成分，但是不同品種中含量有所差異，以‘云粉暈’樣品中山奈酚三糖苷成分的含量最高，‘瞿麥’的含量次之，‘云紫云’和‘狂歡’的含量最低。其他品種之間含量差異較小。‘云粉暈’、‘瞿麥’、‘紫羅蘭’、‘GF’、‘BRINA’5個(gè)品種的含量顯著高于其他11個(gè)品種。大體上可以看出Dianthusbarbatus種含量較高，Dianthussuperbus其次，Dianthuscaryophyllus種含量略低。通過(guò)不同顏色含量的對(duì)比，本研究未發(fā)現(xiàn)山奈酚三糖苷的含量與花色有關(guān)。

其次又測(cè)定了‘BRINA’花不同發(fā)育時(shí)期的含量，結(jié)果顯示花蕾期(2～2.5 cm)含量最高，露色期(2.5～3 cm)含量次之，初開期(3～4 cm)的含量最低?？梢钥闯鲭S著花的開放程度，山奈酚三糖苷的含量呈下降趨勢(shì)，且花蕾期、露色期與初開期之間有顯著性差異。最后又測(cè)定了‘BRINA’品種不同部位的含量，結(jié)果顯示不同組織中活性物質(zhì)分布存在顯著差異，山奈酚三糖苷具體含量為花瓣>花萼>葉>莖。隨著石竹多元化的功能性產(chǎn)品開發(fā)，可以依據(jù)不同品種活性成分含量的差異，培育并栽培推廣專用型的石竹品種，也可以根據(jù)目標(biāo)化合物選擇合適的收獲時(shí)間以及采收植物的不同部位。使石竹具有更廣泛的市場(chǎng)前景。

4 結(jié)論

黃酮醇類物質(zhì)是石竹的主要活性成分，具有廣泛的的藥理作用。對(duì)治療疾病和維持人體健康有很大的益處。建立了一種簡(jiǎn)便的、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率較好的測(cè)定石竹中山奈酚三糖苷的方法。測(cè)定結(jié)果表明，山奈酚三糖苷的積累在不同品種、不同部位以及不同發(fā)育時(shí)期上都有明顯的差異。隨著花的開放程度，山奈酚三糖苷的含量呈下降趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用石竹植物資源提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。