吳柱連，周 紅，汪彩珠，林若蕓，陳煥華，孫克儉，趙 鑫，甘賢優(yōu)，舒金輝

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，南寧 530000)

常規(guī)體外受精(in vitro fertilization,IVF)輔助生殖周期中，卵子低受精(<30%)和完全受精失敗發(fā)生率約為5%～10%[1]，而不明原因原發(fā)性不孕患者宮腔內(nèi)人工授精(intrauterine insemination,IUI)失敗后行IVF助孕完全受精失敗發(fā)生率約為20%[2]。受精失敗往往導(dǎo)致患者可利用胚胎數(shù)減少，甚至因無胚胎可移植而取消周期，給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)。因此，預(yù)判受精結(jié)局，提前做好相關(guān)準(zhǔn)備是保證患者助孕成功的第一步。短時受精行早受精觀察+補(bǔ)救ICSI是目前避免IVF受精失敗的重要手段。但有研究表明，短時受精導(dǎo)致多精受精率增加，并認(rèn)為可能是由于短時受精過早地拆除顆粒細(xì)胞使卵母細(xì)胞過早脫離卵丘顆粒細(xì)胞微環(huán)境，以及機(jī)械操作損傷卵母細(xì)胞透明帶，最終導(dǎo)致多精受精發(fā)生[3]。因此，有些中心并非對所有患者行常規(guī)早受精觀察(拆除顆粒細(xì)胞)，而是有針對性地對受精失敗高風(fēng)險患者進(jìn)行早受精觀察。目前已有很多研究從臨床參數(shù)[4]、分子生物學(xué)[5-9]、免疫[10]等方面分別分析了受精失敗相關(guān)的風(fēng)險因素，但至今尚無確切有效的預(yù)測受精失敗的方法，也未見能有效預(yù)測反復(fù)IUI助孕失敗患者改行IVF助孕受精結(jié)局預(yù)測模型的報道。本研究通過探討反復(fù)IUI失敗患者行IVF受精失敗的危險因素并建立logistic回歸預(yù)測模型，篩選出受精失敗高風(fēng)險人群，為胚胎實驗室預(yù)判受精結(jié)局、開展相關(guān)補(bǔ)救工作提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料收集 回顧分析2020年1月～2021年11月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心因經(jīng)3次IUI助孕未孕改行常規(guī)IVF治療的201對患者夫婦的病例資料(IVF第1周期)。排除標(biāo)準(zhǔn)：未成功獲卵，卵子成熟率小于30%。

1.2 受精診斷與分組 受精后16～18h在倒置顯微鏡下觀察受精情況，出現(xiàn)雙原核判斷為受精。受精率=(受精數(shù)/總獲卵數(shù))×100%。根據(jù)IVF受精情況(補(bǔ)ICSI周期中ICSI部分卵子的受精情況不列入統(tǒng)計分析)分為受精失敗組(包括完全受精失敗和低受精，受精率<30%)及受精正常組(受精率≥30%)。

1.3 研究方法

1.3.1 促排卵治療 采用常規(guī)促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotrophin-releasing hormone agonist，GnRHa)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)促排卵方案。通過陰道B超和激素測定監(jiān)測卵泡生長情況，當(dāng)1個優(yōu)勢卵泡直徑≥18mm或2個優(yōu)勢卵泡直徑≥17mm時肌注HCG(Serono，瑞士)10000IU，36h后陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。

1.3.2 精液采集和處理 丈夫禁欲3～7d，手淫法收集當(dāng)天新鮮精液，按WHO第5版《人類精液檢驗與處理實驗室檢驗手冊》推薦的方法進(jìn)行精液質(zhì)量分析。采用密度梯度離心法洗滌、上游，調(diào)至精子密度為(1～5)×106/mL并制作受精滴。

1.3.3 受精過程和補(bǔ)救ICSI 取卵后3～4h(HCG肌注后39～40h)把卵子加到預(yù)先制作的受精滴中；4～6h后將卵子轉(zhuǎn)移至不含精子的液滴中。對受精失敗高風(fēng)險患者于加精4～6h后剝除部分卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞行早受精觀察。以排出第二極體判斷為受精，受精率=(受精數(shù)/總獲卵數(shù))×100%。受精率<30%，判斷為受精失敗，立即予補(bǔ)救ICSI。

2 結(jié) 果

2.1 受精正常組和受精失敗組患者的一般臨床資料比較 共納入201個IVF周期，其中受精失敗組周期31個，受精正常組周期170個。兩組的女方平均年齡、女方不孕年限、男方不育類型、男方不育年限、處理前精子前向運(yùn)動精子百分率和處理前精子正常形態(tài)百分率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 受精失敗組和正常受精組參數(shù)比較

2.2 IVF受精失敗預(yù)測模型的建立 將單因素分析中P﹤0.25[11]的變量(女方平均年齡、女方不孕年限、女方不孕類型、男方年齡、男方不育類型、男方不育年限、處理前精子前向運(yùn)動精子百分率和處理前精子正常形態(tài)百分率)納入候選預(yù)測變量進(jìn)行l(wèi)ogistic逐步回歸分析，建立受精失敗預(yù)測模型。得出最佳模型中包含了女方不孕類型、女方不孕年限、男方不育類型、前向運(yùn)動精子百分?jǐn)?shù)和正常精子形態(tài)率五個變量?；貧w分析結(jié)果表明，女方不孕年限、男方不育類型和處理前精子形態(tài)正常率是受精失敗的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，模型方程：(1)p=ex/(1+ex);(2)X=-1.969+(-0.380×女方不孕類型)+(0.253×女方不孕年限)+(1.511×男方不育類型)+(-0.025×前向運(yùn)動精子百分?jǐn)?shù))+(-0.210×正常精子形態(tài)率)。方程中p為logistic模型預(yù)測概率，e為自然對數(shù)(e=2.718)。見表2。

表2 logistic回歸分析結(jié)果

2.3 IVF受精失敗預(yù)測模型的評價 通過分類交互表計算Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗統(tǒng)計量(χ2=3.823,df=8,P=0.873),差異無統(tǒng)計學(xué)意義,模型擬合觀察數(shù)據(jù)良好。通過預(yù)測-觀察交互分類表對模型預(yù)測的準(zhǔn)確性進(jìn)行評價。將樣本觀察數(shù)據(jù)回代到該預(yù)測模型,得到對樣本進(jìn)行受精失敗預(yù)測的概率值,根據(jù)約登指數(shù)計算最優(yōu)預(yù)測概率分界值(P=0.186)，靈敏度為74.2%,特異度為75.3%。根據(jù)IVF受精失敗預(yù)測概率，繪制ROC曲線，曲線下面積為0.780(95%CI為0.691～0.868)(圖1)。

圖1 預(yù)測概率ROC曲線

3 討 論

3.1 受精失敗的影響因素 受精包括獲能、頂體反應(yīng)、穿過顆粒細(xì)胞、與透明帶結(jié)合穿過透明帶、卵胞質(zhì)融合及精子核解聚等步驟，在此過程中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都可能導(dǎo)致受精失敗。卵子因素、精子因素、受精過程以及培養(yǎng)微環(huán)境也可導(dǎo)致受精失敗。目前關(guān)于精子形態(tài)在體外受精失敗中的預(yù)測價值作用存在爭議[12]。研究表明,體外受精失敗組的精子正常形態(tài)率顯著低于受精正常組，建議采用常規(guī)IVF受精時，應(yīng)關(guān)注精子的畸形率[13]。一項包含了3922例常規(guī)IVF和843例ICSI周期的回顧性研究表明，在常規(guī)IVF中，正常精子形態(tài)百分率下降，受精率隨之下降；而在ICSI周期中受精率則不受影響[14]。但有文獻(xiàn)表明，精子形態(tài)對IVF受精結(jié)局沒有顯著影響。Keegan等[15]研究表明，精子正常形態(tài)百分率分別為0%、1%、2%、3%、4%、5%～7%和>7%的受精率、囊胚形成率、種植率和臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。研究表明，精子形態(tài)對IVF受精率和優(yōu)胚率沒有影響，但是精子畸形率高，卵裂率降低[16]。本研究結(jié)果表明，在反復(fù)IUI失敗后行IVF助孕患者中，精子形態(tài)正常率是受精失敗的獨(dú)立危險因素(P=0.007，OR=0.81)；受精失敗組的平均精子形態(tài)正常率為4.24%，而受精正常組為6.84%。有研究認(rèn)為，精子形態(tài)對IVF結(jié)局影響的數(shù)據(jù)異質(zhì)性，可能與精子形態(tài)學(xué)的評估具有高度主觀性，易出現(xiàn)實驗室間和實驗室內(nèi)差異有關(guān)[17]。

女性年齡對IVF結(jié)局有明顯影響。女方年齡增加可引發(fā)線粒體功能障礙、非整倍體增加和表觀遺傳變化等問題[18]。Milan等[19]認(rèn)為，在非男方因素不孕的常規(guī)IVF受精失敗病例中，女方年齡大、獲卵數(shù)少的特點尤為突出。本研究中，12例患者獲卵數(shù)≤5個，女方年齡(33.92±2.84)歲，平均獲卵數(shù)(3.25±1.06)個，均正常受精(可能與本研究女方平均年齡小有關(guān))。因此，本研究并未將獲卵數(shù)少的病例排除。卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量影響受精結(jié)局。本研究中，受精失敗組的女方平均年齡顯著小于受精正常組，獲卵數(shù)稍多于正常受精組。相對于高齡女性，年輕女性沒有明顯的線粒體功能、非整倍體和表觀遺傳變化等問題，受精結(jié)局理論上應(yīng)優(yōu)于高齡女性。但是，年輕女性獲卵數(shù)較多，卵子成熟率降低、成熟度不夠的情況下，受精率反而可能下降。卵母細(xì)胞成熟度不夠是導(dǎo)致IVF受精失敗的重要因素，卵母細(xì)胞胞質(zhì)不成熟可導(dǎo)致卵子激活失敗，不能完成第二次減數(shù)分裂，進(jìn)而影響受精率[20]。男性年齡增加，伴隨精液體積減少、精子DFI升高以及精子損傷修復(fù)能力下降等問題[21-22]。本研究結(jié)果表明，受精失敗組和受精正常組的女方年齡存在顯著差異(P<0.05)，而男方年齡差異不顯著(P>0.05)。

本研究結(jié)果顯示，原發(fā)不孕是受精失敗的危險因素，原發(fā)不孕患者的受精失敗率為17.83%，與文獻(xiàn)報道受精失敗發(fā)生率約20%大致相符[2]。此外，較長不孕年限、存在男方不育因素行常規(guī)IVF時也可能更易發(fā)生受精障礙[23]。多項研究表明，女方IVF-ET完全受精失敗及低受精率與不孕年限和不孕類型等相關(guān)[24-25]。

3.2 預(yù)測受精失敗的方法 目前，雖然有些精子功能檢測方法，如透明帶結(jié)合試驗有一定預(yù)測價值，但這些方法操作步驟復(fù)雜且材料來源困難，尚不能在臨床常規(guī)檢驗中應(yīng)用。文獻(xiàn)報道，優(yōu)選后精子的頂體異常率、精子畸形指數(shù)和DNA碎片指數(shù)(DFI)對IVF受精失敗均有預(yù)測價值[4]。值得注意的是，取卵當(dāng)天優(yōu)選精子后不便開展以上相關(guān)試驗，而非取卵日的常規(guī)精液檢查先行精液優(yōu)選再做精液檢測相關(guān)試驗需消耗大量人力物力，目前不易推廣。此外，精子DFI對受精結(jié)局的預(yù)測能力備受爭議，ASRM(American Society for Reproductive Medicine)也不推薦對體外受精助孕患者常規(guī)行DFI檢測。也有報道使用運(yùn)動精子總數(shù)預(yù)測體外受精中的受精結(jié)局，認(rèn)為洗滌后前向運(yùn)動精子總數(shù)是體外受精失敗的可靠預(yù)測指標(biāo)[26]。本中心行IUI助孕患者要求洗滌后前向運(yùn)動精子總數(shù)>10×106，遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)中提到的受精失敗高風(fēng)險值，因此本文未將前向運(yùn)動精子總數(shù)納入受精失敗分析指標(biāo)。

反復(fù)IUI失敗后的患者一般首選IVF-ET方式繼續(xù)治療，這些患者中約20%發(fā)生低受精或完全受精失敗[2,27]。本研究中，3次IUI失敗后行IVF助孕的患者中受精失敗者占15.42%，與報道大致相符。有學(xué)者提出對反復(fù)IUI治療失敗(不明原因不孕)的患者直接行ICSI助孕，以避免IVF受精失敗[28]。但是，也有學(xué)者認(rèn)為，ICSI技術(shù)的安全性不容被忽視。通過ICSI技術(shù)把自然情況下很難受精的精子直接注入卵子內(nèi)，不可避免地對卵子造成一定程度的損害，而且逃避自然選擇的精子也有可能將基因缺陷傳給下一代，因此其應(yīng)用應(yīng)僅限于有適應(yīng)證者，避免ICSI應(yīng)用的擴(kuò)大化[29]。對反復(fù)IUI治療失敗患者用預(yù)測模型進(jìn)行受精結(jié)局預(yù)測，針對受精失敗高危和非高?；颊吆罄m(xù)助孕方式制定個性化方案，更有利于在保證受精率的同時避免ICSI的應(yīng)用擴(kuò)大化。

綜上所述，本研究建立的預(yù)測模型納入指標(biāo)都是臨床工作中常規(guī)記錄和檢測指標(biāo)，方法簡單，所建立的受精失敗預(yù)測模型對反復(fù)IUI失敗后患者行IVF受精失敗有良好的預(yù)測價值。當(dāng)預(yù)測概率P>0.186時，受精失敗風(fēng)險較大，胚胎實驗室技術(shù)員應(yīng)對這部分患者進(jìn)行早受精觀察并及時行補(bǔ)救ICSI，既能減輕因IVF受精失敗給患者帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，又能控制ICSI的應(yīng)用范圍，避免其擴(kuò)大化。