孫一卿，申曉暢，顏 磊，趙興波

(1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，濟南 250021；2.山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，濟南 250001)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是最常見的婦科三大惡性腫瘤之一，近年來，EC發(fā)病率逐漸升高，2020年世界范圍內(nèi)EC的發(fā)病率位居第六位[1-2]。I型EC占EC的80%，病理類型為子宮內(nèi)膜樣癌，其危險因素包括雌激素暴露、絕經(jīng)延遲、遺傳因素、代謝綜合征等[3]。大多數(shù)EC確診時為早期，手術(shù)治療預(yù)后良好，但晚期患者5年生存率低于20%，預(yù)后較差[4]。因此，有待尋找新的治療靶點，進一步開發(fā)研究，以實現(xiàn)個體化的靶向治療。NLR家族含CARD結(jié)構(gòu)蛋白3(NLR family CARD-containing 3,NLRC3)是核苷酸結(jié)合寡聚化域NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)家族成員之一，為進化上高度保守的模式識別受體[5]，是炎癥信號通路的負(fù)性調(diào)控因子[6-7]，且與免疫調(diào)控有關(guān)[8-10]。研究表明，NLRC3與結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤發(fā)展密切相關(guān)[11-15]。本文擬探討NLRC3在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達及其對子宮內(nèi)膜樣癌細胞系的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織標(biāo)本 新鮮手術(shù)標(biāo)本取自于山東省立醫(yī)院婦科行手術(shù)的44例患者，其中子宮內(nèi)膜樣癌28例(癌與癌旁配對標(biāo)本8對，來自同一患者)，對照內(nèi)膜組織16例來自子宮肌瘤患者。28例子宮內(nèi)膜樣癌手術(shù)標(biāo)本患者臨床資料:年齡<55歲12例，≥55歲16例；絕經(jīng)20例，未絕經(jīng)8例；病理類型均為腺癌；臨床分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例；組織學(xué)分化：高分化8例，中分化18例，低分化2例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移1例，無轉(zhuǎn)移27例。石蠟切片取自山東省立醫(yī)院病理科，子宮內(nèi)膜樣癌30例，子宮肌瘤內(nèi)膜組織10例。30例子宮內(nèi)膜樣癌切片患者臨床資料：年齡<55歲15例，≥55歲15例；絕經(jīng)18例，未絕經(jīng)12例；病理類型均為腺癌；臨床分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期4例，Ⅲ期4例；組織學(xué)分化：高分化10例，中分化10例，低分化10例；均無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。標(biāo)本獲取醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號：2021-128)，征得患者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 細胞 子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa(ISK，高分化)和KLE(低分化)購自武漢普諾賽公司。

1.1.3 裸鼠 雌性Balb/c nude小鼠(5周齡)購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，并通過蘇州西山生物技術(shù)有限公司質(zhì)量檢測。動物實驗經(jīng)醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.4 主要試劑 DMEM、DMEM/F12購于Gibco公司，胎牛血清購于BI公司，雙抗(青霉素和鏈霉素(P/S)購自HyClone公司；Transwell小室及Matrigel膠購自Corning公司。NLRC3基因來自NCBI(NM_178844)，NLRC3過表達慢病毒及陰性對照慢病毒購自吉凱公司。SDS-Page凝膠快速制備試劑盒購自雅酶公司，預(yù)染蛋白ladder 26616購自賽默飛公司，兔抗人NLRC3單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、兔抗人N-cadherin單克隆抗體、兔抗人Vimentin單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗人GAPDH單克隆抗體購自武漢三鷹公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG購自博士德公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購自Millipore公司。免疫組化SP法試劑盒、蘇木素染色液、DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司。RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、4%多聚甲醛、結(jié)晶紫染色液購自索萊寶公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫可進行基因表達譜動態(tài)分析，該數(shù)據(jù)庫包含來自The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫和The Genotype-Tissue Expression(GTEx)數(shù)據(jù)庫的174例子宮內(nèi)膜癌樣本和94例對照樣本。應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫分析NLRC3在子宮內(nèi)膜癌組織和對照子宮內(nèi)膜組織中的表達，并分析NLRC3與無病生存率及腫瘤分期的關(guān)系。

1.2.2 免疫組化染色 石蠟包埋切片4μm,按順序脫蠟、脫水、抗原修復(fù)，按免疫組化SP法試劑盒說明書處理切片，滴加DAB顯色液，顯微鏡下出現(xiàn)棕色顆粒時終止反應(yīng)，蘇木素染色，鹽酸酒精分化后反藍，脫水、封片。評分標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下隨機選取5個視野，染色強度淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分，無染色0分；染色陽性細胞數(shù)小于30% 1分，30%～60% 2分，大于60% 3分。陽性評分=染色強度×染色面積/5，0分為陰性，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中度陽性(++)，7～9分為強陽性(+++)。

1.2.3 Western blot檢測 配制蛋白裂解液，提取細胞和組織標(biāo)本總蛋白；用BCA試劑盒測定蛋白濃度；蛋白質(zhì)樣品通過10% SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜；室溫下5%脫脂牛奶封閉1h；一抗孵育過夜；室溫孵育二抗1h；TBST洗滌后顯影。

1.2.4 細胞培養(yǎng) ISK細胞應(yīng)用90% DMEM+10% FBS+1%雙抗培養(yǎng)，KLE細胞應(yīng)用90% DMEM/F12+10% FBS+1%雙抗培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。

1.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染 ISK、KLE細胞分別轉(zhuǎn)染NLRC3過表達慢病毒及陰性對照病毒(標(biāo)記為ISK-NLRC3/ISK-NC，KLE-NLRC3/KLE-NC)，轉(zhuǎn)染72h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，經(jīng)嘌呤霉素篩選后建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后NLRC3表達。

1.2.6 細胞平板克隆實驗 將ISK細胞每組2000個、KLE細胞每組500個分別接種到6孔板，應(yīng)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3d換液。14d后，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15min，蘇木精染色10min。PBS再次洗滌并干燥。觀察克隆細胞數(shù)并計算克隆形成率(克隆形成率=克隆細胞數(shù)/接種細胞數(shù)×100%)。

1.2.7 劃痕實驗 將KLE、ISK各組細胞接種到6孔板，密度達到90%時，應(yīng)用200μL移液器吸頭在貼壁細胞上劃痕。用PBS沖洗懸浮細胞，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。分別計算0、24、48h的劃痕愈合率。

1.2.8 Transwell遷移和侵襲實驗 Transwell遷移實驗：KLE、ISK穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系調(diào)整細胞密度分別為3×104細胞/200μL、5×104細胞/200μL。上室接種200μL無血清細胞懸液，下室應(yīng)用500μL含20% FBS的完全培養(yǎng)基。48h后取出小室，多聚甲醛固定20min，結(jié)晶紫染色30min，觀察穿膜細胞數(shù)并計數(shù)。Transwell侵襲實驗：Matrigel膠和無血清培養(yǎng)基1︰7混合，取100μL鋪于上室，置37℃細胞培養(yǎng)箱1h。KLE、ISK穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系調(diào)整細胞密度分別為9×104細胞/200μL、12×104細胞/200μL。后續(xù)步驟同遷移實驗。

1.2.9 裸鼠皮下成瘤模型建立 裸鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境下，將KLE-NLRC3組和KLE-NC組細胞(3×106細胞/100μL)分別注射到裸鼠左右上肢皮下(n=5/組)，21d后，剝除移植瘤電子天平稱重。

2 結(jié) 果

2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析NLRC3在子宮內(nèi)膜癌中的表達 NLRC3在子宮內(nèi)膜癌中的表達量低于對照組，NLRC3高表達與患者無病生存期有關(guān)，且在Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌中的表達降低。見圖1。

圖1 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析 NLRC3 在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其與子宮內(nèi)膜癌無病生存率、腫瘤分期的關(guān)系

2.2 免疫組化、Western blot法檢測NLRC3在子宮內(nèi)膜癌中的表達 免疫組化結(jié)果顯示，NLRC3在子宮內(nèi)膜樣癌組織中表達降低(P<0.0001)，且隨著腫瘤分化程度降低，NLRC3表達逐漸降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，NLRC3在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達低于對照子宮內(nèi)膜(P=0.0041)，NLRC3在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達低于配對癌旁組織(P=0.039)。見圖2。

圖2 NLRC3 在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達

2.3 NLRC3對子宮內(nèi)膜癌細胞EMT的影響 ISK細胞轉(zhuǎn)染NLRC3過表達慢病毒后，EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。KLE細胞轉(zhuǎn)染NLRC3過表達慢病毒后，E-cadherin表達有下降趨勢(P>0.05)，N-cadherin、Vimentin表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 NLRC3對子宮內(nèi)膜癌細胞EMT的影響

2.4 NLRC3對子宮內(nèi)膜癌細胞系增殖的作用 平板克隆實驗表明，細胞接種14d后，KLE、ISK細胞NLRC3過表達組的克隆細胞數(shù)及直徑均小于對照組。ISK細胞中NLRC3、NC組的克隆細胞數(shù)分別為32.67±0.47、67±13.06，克隆形成率分別為(1.63±0.02)%、(3.35±0.65)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0206)。KLE細胞中,NLRC3、NC組的克隆細胞數(shù)分別為140.33±4.03、172.67±10.62，克隆形成率分別為(28.07±0.81)%、(34.54±2.12)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0158)。

2.5 NLRC3對子宮內(nèi)膜癌細胞系遷移、侵襲的作用

2.5.1 劃痕愈傷實驗 ISK細胞中，NLRC3組和NC組的48h劃痕愈合率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0051)；KLE細胞中，NLRC3組24、48h劃痕愈合率均低于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。表明過表達NLRC3可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的平面遷移能力。見表1。

2.5.2 Transwell遷移和侵襲實驗 ISK和KLE細胞中，NLRC3組48h的遷移和侵襲細胞數(shù)均低于NC組(P<0.05)。表明過表達NLRC3可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的垂直遷移和侵襲能力。見表1。

表1 NLRC3對子宮內(nèi)膜癌細胞系遷移、侵襲的作用

2.6 NLRC3對子宮內(nèi)膜癌細胞體內(nèi)增殖的影響 Balb/c nude小鼠在皮下注射KLE細胞7d后出現(xiàn)腫瘤，接種21d后，完整剝除皮下腫瘤并稱重。NLRC3過表達組的腫瘤重量較輕(P=0.0498)。見圖4。

圖4 NLRC3對子宮內(nèi)膜癌細胞體內(nèi)增殖的影響

3 討 論

多項研究表明，慢性炎癥在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，異常炎癥可能是腫瘤形成的重要標(biāo)志物或腫瘤的特征[12]。模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)是宿主先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可激活相關(guān)炎癥信號通路，促進炎癥因子表達，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，啟動防御機制[16]。人體內(nèi)的PRRs主要包括NOD樣受體、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)等[17]。NLRC3是NLRs家族成員之一，可參與調(diào)控NF-κB和STING信號通路[18-19]，其功能障礙可導(dǎo)致炎癥和多種自身免疫疾病[8]。子宮內(nèi)膜可容受胚胎植入，也是腫瘤的易發(fā)部位，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生可能與炎癥和免疫密切相關(guān)。

GEPIA數(shù)據(jù)庫資料分析顯示，NLRC3在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達。本研究通過免疫組化及Western blot實驗驗證NLRC3在子宮內(nèi)膜樣癌中低表達，與數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著腫瘤惡性程度升高，NLRC3表達呈下降趨勢。推測NLRC3可能與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及進展相關(guān)，NLRC3相對高表達的患者具有較好的無病生存時間。

本研究結(jié)果顯示，慢病毒感染后，子宮內(nèi)膜癌細胞中NLRC3過表達，ISK及KLE細胞克隆形成率較對照組下降，細胞增殖能力受到抑制；劃痕愈傷實驗表明，NLRC3過表達抑制細胞的水平遷移能力；Transwell遷移及侵襲實驗表明，NLRC3過表達可使穿膜細胞數(shù)減少，抑制了細胞垂直遷移能力及侵襲能力。EMT是指上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化，其特征為上皮標(biāo)志物表達下降、間充質(zhì)標(biāo)志物表達升高[20-22],是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要過程。上皮細胞極化使細胞獲得間充質(zhì)表型[22]，失去上皮細胞特征，使細胞更具侵襲性[23-24]。過表達NLRC3后，ISK細胞的EMT指標(biāo)(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)表達無明顯改變，即NLRC3對高分化ISK的EMT無明確影響；而在低分化KLE細胞中，間充質(zhì)表型N-cadherin、Vimentin表達下降，提示KLE細胞的EMT能力被抑制。本研究中，ISK細胞為子宮內(nèi)膜腺癌高分化細胞，KLE細胞為低分化轉(zhuǎn)移灶細胞[25]，兩種細胞在惡性程度方面存在不同，KLE細胞具有更高的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。因此，在EMT檢測中，KLE細胞間充質(zhì)標(biāo)志物明顯降低。低分化KLE細胞具有更高的惡性潛能，細胞增殖較快，成瘤能力強，過表達NLRC3可抑制腫瘤細胞生長。

綜上所述，NLRC3在子宮內(nèi)膜樣癌中低表達，可影響子宮內(nèi)膜癌細胞系的增殖和轉(zhuǎn)移，并可作為無瘤生存率的預(yù)測指標(biāo)之一，也是進一步研究開發(fā)靶向治療的潛在靶點。NLRC3對免疫調(diào)節(jié)的影響以及NLRC3調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞的信號通路仍需進一步研究。