王黎霞，張 鵬，張建軍，安 健

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 房山 102442 ；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)示范中心，北京 昌平 102206)

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte macrophagocyte colony stimulating factor，GM-CSF)在集落刺激因子家族中有重要作用[1]，其能激發(fā)造血干細(xì)胞和不同類型的生血祖細(xì)胞增生和異化[2]，增強(qiáng)DNA疫苗對(duì)被免疫動(dòng)物的保護(hù)效果[3]，提升單抗原的免疫力，增強(qiáng)白介素-2的生成，活化CD4+T細(xì)胞，增加抗體的分泌，同時(shí)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞活性。

人源GM-CSF和鼠源GM-CSF在畢赤酵母表達(dá)的研究報(bào)告較多[4-5]，國(guó)內(nèi)外畢赤酵母表達(dá)雞重組GM-CSF(rchGM-CSF)及其活性測(cè)定的報(bào)道罕見，為此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)海蘭灰蛋雞GM-CSF(chGM-CSF)基因進(jìn)行序列改造，刪除N端的信號(hào)肽基因序列，選擇畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行rchGM-CSF的表達(dá)，利用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)定其免疫促進(jìn)效果，為細(xì)胞因子佐劑的研制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒，均為Axygen公司產(chǎn)品；pGEM-T克隆質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA、畢赤酵母GS115，均為Promega公司產(chǎn)品；T4 DNA限制性內(nèi)切酶EcoR I、NotI、連接酶，均為TaKaRa公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG-HRP、濃縮型DAB試劑盒、RPMI1640、淋巴細(xì)胞分離液、WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，均為碧云天公司產(chǎn)品；His Ab-1、鼠抗His單克隆抗體、Ni-NTA HIS·Bind Resin、Ni-NTA Buffer Kit、Chromatography Columns，均為Novagen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1chGM-CSF去信號(hào)肽的編碼區(qū)(Coding sequences,CDS)擴(kuò)增 據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)chGM-CSF基因序列設(shè)計(jì)引物、克隆、測(cè)序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中chGM-CSF基因片段進(jìn)行序列比對(duì)，確定為chGM-CSF基因，利用SignalP 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)和SignalP-HMM算法預(yù)測(cè)序列的信號(hào)肽，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)去信號(hào)肽的蛋白質(zhì)CDS引物，預(yù)期片段大小為389 bp。上游引物：5′-CCGAATTCTACTCCTGCTGCTACAAAGT-3′，下游引物：5′-GCGGCCGCTTGGATGCAGTCTTTCTC-3′。反應(yīng)體系(50 μL)：pGEX-6p-1/chGM-CSF 1 μL，10×Buffer 5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，dNTP 2 μL，滅菌超純水39.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中chGM-CSF基因比對(duì)，確定信號(hào)肽CDS是否去掉。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化JM109菌和陽(yáng)性菌篩選 將chGM-CSF基因PCR產(chǎn)物及pPICZαA質(zhì)粒用EcoR I和NotI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。將純化的片段與質(zhì)粒連接，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/chGM-CSF，轉(zhuǎn)化JM109菌，克隆、篩選，小量提取質(zhì)粒，EcoR I、NotI酶切和PCR鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母和陽(yáng)性酵母克隆篩選 將1.2.2中篩選的陽(yáng)性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，純化重組質(zhì)粒pPICZαA/chGM-CSF，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，同時(shí)，設(shè)空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化對(duì)照組作為后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照。電轉(zhuǎn)化的畢赤酵母用Zeocin抗生素篩選，對(duì)陽(yáng)性單菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化組和pPICZαA/chGM-CSF電轉(zhuǎn)化組的畢赤酵母質(zhì)粒，用AOX通用引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 rchGM-CSF小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 分為4個(gè)組，A組：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母甲醇未誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h對(duì)照組；B組：未經(jīng)轉(zhuǎn)化的畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d對(duì)照組；C組：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d對(duì)照組；D組：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)1～4 d試驗(yàn)組，收集各組培養(yǎng)上清，SDS-PAGE后硝酸銀染色，以抗His單抗為一抗通過(guò)Western blot鑒定rchGM-CSF的表達(dá)。

1.2.5 rchGM-CSF的大量表達(dá)及純化 大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)rchGM-CSF，收集第3天培養(yǎng)液200 mL，離心分離上清，采用超濾法除鹽濃縮為5 mL，Ni-NTA柱純化[6]，SDS-PAGE后硝酸銀染色鑒定，并以抗His單抗為一抗進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.6 rchGM-CSF生物活性鑒定 利用分光光度計(jì)在280 nm處對(duì)重組蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，調(diào)整重組蛋白濃度為20 μg/mL，按1∶5、1∶25、1∶125、1∶625比例稀釋，同時(shí)設(shè)不加rchGM-CSF的細(xì)胞對(duì)照。無(wú)菌取健康雞脾臟，剪碎成1 mm3的小塊，按常規(guī)方法分離淋巴細(xì)胞[7]，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞終濃度為3.0×106個(gè)/mL；取50 μL淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞板中，用MTT試驗(yàn)鑒定不同稀釋倍數(shù)的rchGM-CSF的生物活性[7]。

2 結(jié)果

2.1chGM-CSF去信號(hào)肽的CDS擴(kuò)增 分析克隆得到的chGM-CSF基因，發(fā)現(xiàn)其具有潛在的信號(hào)肽，信號(hào)肽位于5′端的72 bp。重新設(shè)計(jì)引物，PCR得到chGM-CSF新序列長(zhǎng)度為389 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中chGM-CSF基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，新序列在GAATTC酶切位點(diǎn)后缺失了72 bp，表明信號(hào)肽被成功去掉。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化JM109菌和陽(yáng)性菌篩選 將雙酶切后回收純化的pPICZαA質(zhì)粒與chGM-CSF片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109菌、篩選陽(yáng)性克隆、培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，結(jié)果顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/chGM-CSF構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 pPICZαA/chGM-CSF的PCR鑒定(A)和雙酶切鑒定(B)

2.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母和陽(yáng)性酵母克隆篩選 重組表達(dá)質(zhì)粒(試驗(yàn)組)和空質(zhì)粒(對(duì)照組)分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在含100 μg/mL Zeocin YPD固體培養(yǎng)基上篩選畢赤酵母菌落，用AOX通用引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳鑒定，結(jié)果顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母出現(xiàn)930 bp的條帶，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母出現(xiàn)591 bp的條帶，說(shuō)明篩選的畢赤酵母為陽(yáng)性重組克隆(圖2)。

圖2 電轉(zhuǎn)pPICZαA對(duì)照組(A)和電轉(zhuǎn)pPICZαA/chGM-CSF試驗(yàn)組(B)酵母菌落的PCR鑒定

2.4 rchGM-CSF小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 收集各對(duì)照組(A組、B組和C組)和試驗(yàn)組(D組)的培養(yǎng)上清，SDS-PAGE后硝酸銀染色發(fā)現(xiàn)，第1～4天D組的誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)上清在20 kDa處有1條清晰的條帶，各對(duì)照組無(wú)該條帶(圖3A)，說(shuō)明甲醇誘導(dǎo)了重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母表達(dá)了rchGM-CSF?；叶葤呙璺治霭l(fā)現(xiàn)，第3天和第4天 rchGM-CSF表達(dá)量最多。采用Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，D組有1條20 kDa的蛋白條帶(圖3B)，說(shuō)明rchGM-CSF由甲醇誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖3 培養(yǎng)上清的SDS-PAGE鑒定(A)和Western blot鑒定(B)

2.5 rchGM-CSF的大量表達(dá)及純化 分離畢赤酵母培養(yǎng)物200 mL，離心收集上清液，濃縮后Ni-NTA柱純化，純化后的rchGM-CSF經(jīng)SDS-PAGE和硝酸銀染色鑒定顯示，rchGM-CSF被第2～3根柱長(zhǎng)體積的洗脫液洗脫純化，大小為20 kDa和17 kDa(圖4A)，經(jīng)Western blot鑒定，條帶大小也是20 kDa和17 kDa(圖4B)，表達(dá)量分析表明，誘導(dǎo)表達(dá)第3天，rchGM-CSF在上清中表達(dá)量達(dá)5 mg/L。

圖4 純化rchGM-CSF的SDS-PAGE鑒定(A)和Western blot鑒定(B)

2.6 rchGM-CSF生物活性鑒定 MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，rchGM-CSF按1∶5稀釋與按1∶25、1∶125、1∶625稀釋及細(xì)胞對(duì)照相比，可極顯著地促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01)；按1∶25稀釋與按1∶125、1∶625稀釋及細(xì)胞對(duì)照相比，可顯著地促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05)。結(jié)果表明，純化的rchGM-CSF有較好的生物活性(圖5)。

圖5 MTT法鑒定rchGM-CSF生物活性

3 討論

目前，蛋白異源表達(dá)系統(tǒng)有經(jīng)過(guò)改造的昆蟲細(xì)胞系、改造后大腸埃希菌工程菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、酵母菌和雞柔嫩艾美耳球蟲等[8]。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是異源蛋白可進(jìn)行糖基化和甲基化等的修飾[9]。本試驗(yàn)利用帶有6His標(biāo)簽的pPICZαA質(zhì)粒，在甲醇存在時(shí)表達(dá)外源基因。rchGM-CSF可被His親和柱吸附，混雜的蛋白則不能被吸附而被洗脫，再用高濃度咪唑洗脫液將吸附柱上的His異源蛋白洗脫，在洗脫液中得到純化的rchGM-CSF。本試驗(yàn)中甲醇誘導(dǎo)第3天的培養(yǎng)液的rchGM-CSF表達(dá)量達(dá)5 mg/L，可以滿足對(duì)rchGM-CSF的活性功能的研究，具有重要的實(shí)踐意義。

Srinivasa等研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母表達(dá)的人和小鼠等動(dòng)物的GM-CSF都具有不同數(shù)量的氨基酸被糖基化，其分子量要比預(yù)測(cè)的大，SDS-PAGE和Western blot鑒定時(shí)，條帶的大小比理論值大3～5 kDa[4]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，rchGM-CSF的分子量也有增大。經(jīng)His親和柱純化后，得到的2個(gè)條帶都能與His單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，分子量較大、數(shù)量較多的條帶是糖基化的結(jié)果，分子量較小、數(shù)量較少的條帶與預(yù)期的蛋白理論大小相符，說(shuō)明大部分異源蛋白都被糖基化。對(duì)小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)的上清液進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定的結(jié)果中并沒有小條帶，可能是沒有純化濃縮的上清液中未糖基化蛋白的濃度低，沒有達(dá)到可檢出的濃度，而純化濃縮后，蛋白的濃度增大，才出現(xiàn)可見的顯色而被發(fā)現(xiàn)。

GM-CSF是一種決定性的細(xì)胞因子，參與多種免疫反應(yīng)，皮膚給予GM-CSF后，注射位的表皮樹突狀細(xì)胞顯著增多，1周左右達(dá)到峰值，部分表皮樹突狀細(xì)胞還可進(jìn)入皮下淋巴組織[10]。同時(shí)，GM-CSF還可顯著地增加核酸疫苗的免疫效果[11]。Dranoff等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠GM-CSF可增強(qiáng)抗腫瘤核酸疫苗的效力，進(jìn)而減少腫瘤細(xì)胞[5]。與單獨(dú)使用痘病毒DNA相比，小鼠GM-CSF的DNA與痘病毒DNA聯(lián)合使用可明顯提升抗體滴度和IFN-γ的濃度，更進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，Tc)的功能[12]。在瘧疾DNA疫苗中也發(fā)現(xiàn)了較為一致的結(jié)果[13]。GM-CSF與C型病毒性肝炎DNA聯(lián)合免疫，能顯著增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫[14]。Somasundaram等研究發(fā)現(xiàn)，GM-CSF能增強(qiáng)偽狂犬病病毒DNA疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生更高水平的IgG1和IgG2，鼻腔排毒量顯著下降，縮短排毒時(shí)間[15]。

GM-CSF與其他細(xì)胞因子同時(shí)使用，可顯著增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果。GM-CSF、IL-2與B型肝炎病毒DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用，可增強(qiáng)昆明小鼠的Thl型細(xì)胞反應(yīng)，IgGl和IgG2α滴度顯著升高，通過(guò)溶細(xì)胞反應(yīng)可明顯減少細(xì)胞數(shù)量[16]。豬GM-CSF與CD40聯(lián)合，可增強(qiáng)核酸疫苗的免疫效果，提高β-gal抗體IgG、IgG2a的水平[17]，也可促進(jìn)Tc顯著增殖[18]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，rchGM-CSF按1∶5稀釋能極顯著地促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，按1∶25稀釋能夠顯著地促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。

綜上，本試驗(yàn)采用畢赤酵母作為表達(dá)系統(tǒng)工具，獲得了雞重組GM-CSF，結(jié)果表明，該異源蛋白促進(jìn)了淋巴細(xì)胞增殖，說(shuō)明其具備增強(qiáng)免疫的作用，為其作為免疫佐劑的進(jìn)一步研究提供了理論支持。