曾 卿 陳小芳 劉 暢 李先恩

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京，100193)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，糖尿病患者數(shù)量迅速增長，給人類健康構(gòu)成了巨大威脅。其中，2型糖尿病作為以高血糖為主要特征的漸進(jìn)性代謝疾病，可以通過調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、口服降糖藥物或皮下注射胰島素等常規(guī)療法進(jìn)行干預(yù)。目前，除噻唑烷二酮類和二甲雙胍這些臨床上應(yīng)用廣泛的降糖藥物以外，有研究發(fā)現(xiàn)中藥中多種有效成分具有溫和的胰島素增敏作用和降血糖作用，對改善糖尿病并發(fā)癥和維持血糖穩(wěn)態(tài)具有一定效果。

梓醇(Catalpol，CAT)是我國傳統(tǒng)中藥中用于治療消渴癥的常用藥地黃[Rehmanniaglutinosa(Gaetn.) Libosch.ex Fisch.et Mey.]的主要成分之一，具有多種藥理活性，如抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和脂質(zhì)代謝紊亂等[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，梓醇通過上調(diào)磷酸化AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase，AMPK)α1/2的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)、葡萄糖代謝紊亂、胰島素抵抗和降低血糖，治療實驗用糖尿病純合子(db/db)小鼠[3]。此外，梓醇也被證明能通過抑制活性氧產(chǎn)生和核因子κB活性來降低由晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products，AGEs)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[4-5]，說明梓醇不僅可以明顯降低血糖水平，還能夠有效改善糖尿病并發(fā)癥[6]，而梓醇對于糖尿病性肝病、腎損傷、視網(wǎng)膜損傷與周圍神經(jīng)病變的干預(yù)作用卻少見報道。因此，有關(guān)梓醇對db/db小鼠中糖尿病性肝腎損傷與膽汁酸水平作用的探究具有重要的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取48只無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級雄性糖尿病鼠(Diabetic Mouse)，簡稱db小鼠，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號：SCXK(京)2019-0008]，飼養(yǎng)地點為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所實驗動物中心[許可證：SYXK(京2017-0020]，飼養(yǎng)環(huán)境濕度50%～65%，溫度22～24 ℃，光照和黑暗時間各12 h。其中選取8只4周齡體質(zhì)量(22±1)g的糖尿病導(dǎo)入m基因雜合子(db/m)雄性小鼠作正常組，以普通維持飼料喂養(yǎng)，其余4周齡體質(zhì)量(19±2)g的實驗用糖尿病純合子(db/db)雄性小鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.1.2 藥物 梓醇(成都瑞芬思生物科技有限公司，貨號：Z-005)；二甲雙胍素片(上海施貴寶制藥有限公司，批號：02000913)。

1.1.3 試劑與儀器 血清白蛋白(中生北控生物科技有限公司，貨號：100020070)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(中生北控生物科技有限公司，貨號：100020010)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(中生北控生物科技有限公司，貨號：100020000)、直接膽紅素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Dogesce公司，貨號：DG94561Q-96)、總膽紅素測定試劑盒(Dogesce公司，貨號：DG91296Q-96)、維生素B12酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海必優(yōu)生物科技有限公司，貨號：P1002)、葉酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Calbiotech公司，美國，貨號：IME00026)、谷胱甘肽和同型半胱氨酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(江西艾博因生物科技有限公司，貨號：IB-E22250)；色譜級乙腈(Fisher公司，美國，貨號：T001014000)、色譜級甲醇(Fisher公司，美國，貨號：LS004524)、色譜級甲酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，貨號：20190517)；膽酸(CA，上海源葉生物有限公司，貨號：B20274)、脫氧膽酸-2,2,4,4-d4(DCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B21032)、甘氨膽酸(GCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B27078)、甘氨石膽酸(GLCA，上海源葉生物有限公司，貨號：S27511)、石膽酸(LCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B28100)、鵝去氧膽酸2,2,3,4,4-d4(CDCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B20347)、豬去氧膽酸(HDCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B21672)、熊去氧膽酸(UDCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B24105)、?；悄懰?TCA，上海麥克林有限公司，貨號：T877269)、?；秦i去氧膽酸(THDCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B26449)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B20919)、?；切苋パ跄懰?TUDCA，上海源葉生物有限公司，貨號：B20921)；高糖高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司，飼料編號：1K65)。1-14冷凍離心機(jī)(Sigma公司，德國，型號：3K15)；旋渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-901)；血糖試紙及血糖儀(羅氏公司，德國，型號：ACTIVE)；全自動生化儀(貝克曼公司，日本，型號：AU480)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB SCIEX公司，美國，型號：Q-Trap 5500)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后測定小鼠空腹血糖2次，若2次空腹血糖值均大于7.9 mmol/L，則開始給藥。db/m小鼠作正常組，40只造模成功的小鼠隨機(jī)均分為模型組、陽性藥組(二甲雙胍，200 mg/kg)、梓醇低劑量組(150 mg/kg)、梓醇中劑量組(200 mg/kg)和梓醇高劑量組(250 mg/kg)。

1.2.2 給藥方法 正常組和模型組每日灌胃等體積的生理鹽水，各觀察組按給藥劑量每天灌胃1次。給藥8周后，所有小鼠隔夜禁食，摘眼球取血，分離血清，取部分肝臟和眼球固定于甲醛溶液中，其余置于-80 ℃環(huán)境中保存。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 體質(zhì)量、血糖及口服葡萄糖耐量試驗(Oral Glucose Tolerance Tests，OGTT)測定 每周記錄1次小鼠空腹血糖值和體質(zhì)量數(shù)據(jù)。第8周進(jìn)行OGTT，禁食10 h后，每只小鼠灌胃葡萄糖溶液(2 g/kg)，于0 min、30 min、60 min、120 min測定小鼠的血糖值，并計算糖耐量曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)。

1.2.3.2 器官指數(shù)測定 解剖時分別稱取各小鼠完整肝臟和腎臟并稱重，分別計算肝體比和腎體比。器官指數(shù)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.2.3.3 生化指標(biāo)測定 在第8周，收集并記錄小鼠24 h尿量。按試劑盒說明書測定血清中血尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase，GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase，GOT)、血清白蛋白(Albumin，ALB)、總膽紅素(Total Bilirubin，T-Bil)和直接膽紅素(Direct Bilirubin，D-Bil)、間接膽紅素(Indirect Bilirubin，I-Bil)的水平并計算白蛋白-膽紅素(Albumin-Bilirubin，ALBI)值。

ALBI=0.66×log10(T-Bil-0.085×ALB)。

1.2.3.4 血液與肝臟中維生素B12、葉酸和同型半胱氨酸水平測定 于冰水浴條件下，精確稱取小鼠肝臟組織0.5 g，加入9倍量的生理鹽水，制備成10%的勻漿液，3 000 r/min條件下離心10 min(離心半徑5 cm)，取上清液待測，室溫平衡30 min后，依據(jù)試劑盒說明書測定肝臟和血液中維生素B12、葉酸和同型半胱氨酸水平。

1.2.3.5 肝臟和視網(wǎng)膜病理學(xué)檢查 利用蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色法觀察小鼠肝臟和視網(wǎng)膜損傷情況。取適量肝組織，先在4%多聚甲醛中固定48 h，用從低濃度到高濃度的乙醇將其脫水，二甲苯透明后進(jìn)行浸蠟包埋切片。得到的切片再進(jìn)行二甲苯脫蠟脫苯、HE染色、乙醇洗脫、二甲苯透明、中性樹膠封片等流程，使用200倍光學(xué)顯微鏡觀察小鼠視網(wǎng)膜和肝組織病理學(xué)變化。采用半定量分級評分方法對小鼠組織受損情況進(jìn)行評估，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無脂肪變性及炎癥壞死；1分，輕度性脂肪變性及炎癥壞死；2分，中度性脂肪變性及炎癥壞死；3分，重度性脂肪變性及炎癥壞死。

1.2.3.6 測定糖尿病小鼠肝臟中膽汁酸水平 肝臟樣本的采集和前處理：精密稱取肝臟樣品0.5 g，粉碎后加入低溫乙腈，渦旋振蕩1 min后，轉(zhuǎn)速離心10 min(4 ℃，3 000 r/min，離心半徑5 cm)，取上清液，氮氣吹干，殘渣用100 μL 60%甲醇水復(fù)溶，渦旋振蕩1 min后，同條件離心10 min，取上清液待測。1)色譜分析條件：色譜柱為UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相水相為0.1%甲酸水，有機(jī)相為甲醇，梯度洗脫(0～6 min，80%～60%B；6～10 min，60%～50%B；10～15 min，50%～40%B；15～18 min，40%～30%B；18～20 min，30%～80%B)，流速0.2 mL/min，柱溫28 ℃，樣品室溫度4 ℃。進(jìn)樣量為5 μL。2)質(zhì)譜分析條件：配制混標(biāo)溶液[含?；蛆Z去氧膽酸(Taurochenodeoxycholic Acid，TCDCA)、?；悄懰?Taurocholic Acid，TCA)、熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)、膽酸(Cholic Acid，CA)、?；秦i去氧膽酸(Tauroursodeoxycholic Acid，THDCA)、牛磺熊去氧膽酸(Tauroursodesoxycholic Acid，TUDCA)、豬去氧膽酸(Hyodesoxycholic Acid，HDCA)、鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic Acid，CDCA)、石膽酸(Lithocholic Acid，LCA)、去氧膽酸(Deoxycholic Acid，DCA)、甘氨石膽酸(Glycolithocholic Acid，GLCA)和甘氨膽酸(Glycocholic Acid，GCA)各0.78 mg/L、1.21 mg/L、0.165 mg/L、0.06 mg/L、0.086 mg/L、0.02 mg/L、0.06 mg/L、0.056 mg/L、0.019 mg/L、0.028 mg/L、0.014 mg/L、0.048 mg/L]采用針泵進(jìn)樣，用負(fù)離子模式對膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，確定標(biāo)準(zhǔn)品的母離子、子離子，定量離子及定性離子、去簇電壓(Declustering Potential，DP)、碰撞電壓(Collision Potential，CE)、入口電壓(Exit Potential，EP)及出口電壓(Cell Exit Potential，CXP)參數(shù)。優(yōu)化離子源參數(shù)，使各標(biāo)準(zhǔn)品的離子化效率和樣品豐度達(dá)到最佳。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 生化指標(biāo)采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖，并采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；超高效液相色譜法-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜(Ultra-performance Liquid chromatography-quadrupole Linear Ion Trap Mass Spectrometry,UPLC-QTRAP-MS/MS)所采集到的原始數(shù)據(jù)通過Analyst 1.6.2軟件進(jìn)行積分和定量分析，隨后使用SIMCA-P軟件對各組液質(zhì)實驗數(shù)據(jù)采取偏最小二乘法判別分析法進(jìn)行統(tǒng)計分析。為了探究梓醇對糖尿病小鼠肝臟代謝譜中各膽汁酸的影響，對12種膽汁酸的水平進(jìn)行測定，并對其進(jìn)行主成分分析和模型的排列陣列分析。

2 結(jié)果

2.1 梓醇對db/db糖尿病小鼠體質(zhì)量、血糖及糖耐量的調(diào)節(jié)作用 在高糖高脂飼料的誘導(dǎo)下，db/db小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加和血糖升高的變化，同時伴隨著多食、多飲、多尿、嗜睡。見圖1A。各組實驗小鼠的體質(zhì)量均有顯著增加。其中，正常組小鼠體質(zhì)量顯著低于db/db小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，梓醇高劑量組小鼠體質(zhì)量明顯低于模型組(P<0.05)，梓醇在一定程度上控制db/db小鼠的體質(zhì)量。同時也觀察到，高脂高糖飼喂1周后，觀察組db/db小鼠空腹血糖均值升至10 mmol/L以上，造模成功。見圖1B。給藥2周內(nèi)，模型組血糖增加迅速，升至25 mmol/L以上，而從給藥第3周開始，各組小鼠血糖水平進(jìn)入平臺期，且與模型組比較，各給藥組的血糖水平均顯著低于模型組(均P<0.05)，其中梓醇高劑量組小鼠的血糖水平低于陽性藥組小鼠。正常組的糖耐量值顯著低于模型組(P<0.01)；其余各組血糖值在葡萄糖負(fù)荷30 min內(nèi)達(dá)到峰值，其中梓醇高劑量組的血糖峰值略低于陽性藥組，為(10.04±1.93)mmol/L；梓醇中劑量組、梓醇低劑量組的AUC分別減少了41.25%和25.90%，梓醇在一定程度上能夠提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力。見表1。

圖1 梓醇對db/db糖尿病小鼠體質(zhì)量(A) 及血糖(B)的影響

2.2 梓醇對db/db 2型糖尿病小鼠肝腎損傷的調(diào)節(jié)作用 模型組肝體比顯著高于正常組且腎體比顯著小于正常組(P<0.05)；梓醇各劑量組能降低糖尿病小鼠肝體比且更接近正常組水平，但對腎體比的干預(yù)作用不明顯，梓醇能有效改善由糖尿病導(dǎo)致的肝臟肥大(P<0.05)。見圖2。

圖2 梓醇對db/db糖尿病小鼠腎體比(A)和肝體比(B)的調(diào)節(jié)作用

正常組小鼠的肝細(xì)胞緊密，細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列且大小均一，細(xì)胞無壞死及浸潤，肝竇清晰可見。而模型組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞腫脹變性，炎癥細(xì)胞浸潤，有嚴(yán)重壞死，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，大小不一，肝竇消失，肝小葉結(jié)構(gòu)輪廓消失，肝索結(jié)構(gòu)破壞。見圖3。梓醇各劑量組的小鼠肝細(xì)胞相比于模型組有改善，細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡化有明顯減輕。梓醇能改善糖尿病小鼠的肝臟受損情況(P<0.05)。

圖3 梓醇對db/db糖尿病小鼠肝病理的影響(HE染色，×200)

模型組血清中GOT、GPT、血清白蛋白、I-Bil、T-Bil和D-Bil的水平與正常組比較偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而與模型組比較，各梓醇各劑量組均能降低糖尿病小鼠血清中GOT、GPT、I-Bil、T-Bil、D-Bil和GSH的水平，其中梓醇高劑量組表現(xiàn)最佳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而陽性藥組二甲雙胍對肝酶及膽紅素調(diào)節(jié)作用不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

表1 梓醇對db/db小鼠葡萄糖耐受能力的調(diào)節(jié)作用

圖4 梓醇對db/db糖尿病小鼠肝功能的調(diào)節(jié)作用

2.3 梓醇對2型糖尿病小鼠周圍神經(jīng)病變的影響 模型組血清中和肝臟內(nèi)維生素B12、葉酸與同型半胱氨酸水平與正常組比較明顯偏低。梓醇高劑量組和梓醇中劑量組能顯著提高血清和肝臟內(nèi)的維生素B12水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；梓醇各劑量組小鼠均能提高肝臟和血清中葉酸水平，其中梓醇中劑量組表現(xiàn)良好；而梓醇各劑量組小鼠對血清與肝臟中的同型半胱氨酸水平影響較小。見圖5。

圖5 梓醇對db/db糖尿病小鼠周圍神經(jīng)病變的調(diào)節(jié)作用

2.4 視網(wǎng)膜病理學(xué)檢查 正常組小鼠的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，各層細(xì)胞排列整齊，毛細(xì)管無擴(kuò)張充血；模型組小鼠視網(wǎng)膜組織排列紊亂，細(xì)胞腫脹，數(shù)目減少，毛細(xì)管擴(kuò)張充血；而經(jīng)梓醇干預(yù)后的小鼠視網(wǎng)膜損傷得到不同程度的改善，特別是梓醇低劑量組的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，較少細(xì)胞腫脹，毛細(xì)管擴(kuò)張充血現(xiàn)象較少。梓醇能改善db/db糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜損傷。見圖6。

圖6 梓醇對db/db糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病理的影響(HE染色，×200)

2.5 梓醇對db/db 2型糖尿病小鼠肝臟膽汁酸水平的影響

2.5.1 質(zhì)譜母離子、子離子及其條件 在負(fù)離子模式下，對12種膽汁酸的定量離子對、去簇電壓、入口電壓、碰撞電壓和出口電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行測定。見表2。根據(jù)表2數(shù)據(jù)對小鼠肝臟的12種膽汁酸進(jìn)行定量分析。

表2 12種膽汁酸的MS分析參數(shù)

2.5.2 方法學(xué)考察結(jié)果 1)線性關(guān)系及回歸方程：分別精密稱取?；悄懰帷⑿苋パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸2.42 mg、0.33 mg和1.56 mg，溶解于2 mL色譜甲醇中；精密稱取?；秦i去氧膽酸、?；切苋パ跄懰帷⒛懰?、豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸各0.43 mg、0.10 mg、0.30 mg、0.30 mg和0.28 mg，溶解于5 mL色譜甲醇中；精密稱取石膽酸、脫氧膽酸、甘氨膽酸和甘氨石膽酸各0.19 mg、0.28 mg、0.48 mg和0.14 mg，溶解于10 mL甲醇中。采用二倍稀釋法配置成不同濃度的混標(biāo)母液，以峰面積(Y)相對于濃度(X)制作標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。繪制并計算得到該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及相關(guān)系數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)該方法的線性良好，相關(guān)系數(shù)較高，方法可行性良好。見表3。

表3 12種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、線性方程考察結(jié)果

2)加標(biāo)回收率：將已經(jīng)前處理的肝臟樣品，加入混標(biāo)溶液5 mL，測定加標(biāo)回收率，生物樣品的加標(biāo)回收率一般要求在80%～120%。所測定的各膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品的平均加標(biāo)回收率在90.44%～116.02%，符合要求。見表4。

表4 12種膽汁酸的平均加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)

3)48 h穩(wěn)定性及精密度：取配置好的各膽汁酸混標(biāo)溶液于室溫中放置1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h和48 h，按照1.2.3.6項的方法測定各膽汁酸水平并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值，一般生物樣品精密度要求在80%～120%，所測得的各標(biāo)品精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.27%～17.42%，符合要求。見表5。

表5 12種膽汁酸的精密度與48 h穩(wěn)定性及48 h穩(wěn)定性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)

2.5.3 梓醇對db/db小鼠肝臟中膽汁酸水平的影響 R2和Q2的數(shù)值較為接近，說明模型解釋能力尚可。見圖7。主成分分析結(jié)果可知，各組小鼠肝臟膽汁酸譜界限分明，其中梓醇中劑量組的膽汁酸譜相較于陽性藥組更接近于正常組，梓醇中劑量組能改善db/db糖尿病小鼠肝臟中的膽汁酸代謝，有益于糖尿病的調(diào)節(jié)及其并發(fā)癥的改善。見圖8。

圖7 肝臟提取物代謝成分的排列陣列

圖8 肝臟提取物代謝成分的主成分分析

db/db小鼠肝臟的各膽汁酸水平相較于正常小鼠發(fā)生了顯著變化。與正常小鼠不同的是，模型小鼠肝臟中游離型膽汁酸如膽酸和熊去氧膽酸的水平顯著上升(P<0.05)。結(jié)合型膽汁酸如甘氨石膽酸和甘氨膽酸的水平上升顯著(P<0.05)；牛磺結(jié)合型膽汁酸如?；切苋パ跄懰?、牛磺豬去氧膽酸和?；悄懰岬乃綆缀鯚o變化，高血糖狀態(tài)會影響小鼠肝臟膽汁酸代謝且顯著改變其肝臟膽汁酸組成，二者關(guān)系密切。各給藥組藥物干預(yù)8周后，肝臟膽汁酸也發(fā)生變化。首先，梓醇與二甲雙胍均能降低糖尿病小鼠肝臟中游離膽汁酸(膽酸、熊去氧膽酸)和結(jié)合型膽汁酸的水平(甘氨石膽酸、甘氨膽酸)，提高鵝去氧膽酸與去氧膽酸的水平。中劑量梓醇表現(xiàn)更佳，不僅升高了小鼠肝臟中的去氧膽酸(P<0.05)和石膽酸水平(P<0.01)，還能顯著降低糖尿病小鼠肝臟中膽酸(P<0.001)、甘氨膽酸和甘氨石膽酸水平(P<0.05)，使得糖尿病小鼠中的肝臟各膽汁酸含水平趨向正常小鼠。梓醇可能通過調(diào)節(jié)糖尿病小鼠肝臟中的各膽汁酸水平，從而起到一定改善糖尿病的作用。見圖9～10。

圖9 各組db/db糖尿病小鼠肝臟游離型膽汁酸水平比較

圖10 各組db/db糖尿病小鼠肝臟中結(jié)合型膽汁酸水平比較

3 討論

由于缺乏瘦素受體基因，db/db小鼠易在高糖高脂的飼養(yǎng)條件下誘導(dǎo)2型糖尿病且與人罹患糖尿病的進(jìn)程較為相似，現(xiàn)已成為國際上認(rèn)可的探究人2型糖尿病及其并發(fā)癥的動物模型。在評估機(jī)體肝損傷情況時，臨床上常通過檢測機(jī)體血清中的GPT、GOT、血清白蛋白、T-Bil、D-Bil、I-Bil和ALBI值來表征[7-10]，其中ALBI值常用來評估早期肝臟損傷程度。本研究建立的模型小鼠可自發(fā)發(fā)生2型糖尿病，為探究梓醇治療糖尿病及其并發(fā)癥提供了研究基礎(chǔ)。結(jié)合上述測定的各項生化指標(biāo)和組織病理切片結(jié)果可以得知，梓醇不僅有效控制db/db小鼠的體質(zhì)量和血糖，還能改善其糖耐受能力，有效調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的糖代謝紊亂。除了顯著降血糖作用，梓醇在改善糖尿病并發(fā)癥方面發(fā)揮了良好的藥效：不僅可以顯著降低血清中GPT、GOT、T-Bil、I-Bil、D-Bil和GSH水平，還能降低小鼠肝體比、腎體比指數(shù)，減少脂肪在肝臟的堆積，從而改善肝損傷，在一定程度上保證了肝臟的正常功能。除此之外，梓醇能顯著提高2型糖尿病小鼠肝臟中維生素B12和葉酸水平，降低由糖尿病導(dǎo)致的周圍神經(jīng)病變。

膽汁酸作為一種在肝臟中合成的重要代謝產(chǎn)物，通過肝腸循環(huán)參與機(jī)體的膽固醇代謝，從而保證機(jī)體脂質(zhì)代謝的正常運行。進(jìn)食時，膽汁酸隨著膽汁進(jìn)入腸道，經(jīng)腸道及其微生物作用有95%的膽鹽可被重吸收經(jīng)門靜脈入肝，小部分進(jìn)入外圍循環(huán)，以此來維持膽鹽池的穩(wěn)定[11]?，F(xiàn)在越來越多的研究證實膽汁酸能通過激活多種細(xì)胞核受體和膜受體介導(dǎo)的信號通路，參與調(diào)節(jié)多種代謝過程，是一種代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。膽汁酸除了在脂質(zhì)代謝發(fā)揮的不可忽視的作用，如促進(jìn)食物中脂類成分的消化吸收，還能參與葡萄糖代謝[3,12]。膽汁酸能影響腸道激素的合成與分泌，從而調(diào)節(jié)糖代謝。膽汁酸激活胰腺B細(xì)胞中的法尼醇X受體，上調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子19，活化G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5，以及促進(jìn)腸道L細(xì)胞中胰高血糖素樣肽-1的分泌，改善db/db小鼠胰島素抵抗，從而維持葡萄糖代謝平衡[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者體內(nèi)膽汁酸代謝紊亂，可能是由于膽汁酸能夠促進(jìn)膽汁形成和膳食脂質(zhì)吸收，而糖脂代謝的紊亂超出了膽汁酸調(diào)節(jié)能力導(dǎo)致[15]。另有研究表明，法尼酯X受體在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有一定作用，可能是由于膽汁酸激活了法尼酯X受體，從而實現(xiàn)對膽汁酸和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，起到改善糖尿病及其肝臟并發(fā)癥的作用[16-18]。同樣，在大量的實驗動物及人體實驗中也發(fā)現(xiàn)，使用膽汁酸結(jié)合劑后膽汁酸的腸肝循環(huán)受到干擾，血漿中膽固醇水平降低，膽汁酸調(diào)節(jié)作用受到一定抑制，法尼酯X受體激活也受到了抑制，證實法尼酯X受體在膽汁酸和糖代謝之間的橋梁作用[14,19-20]。除此之外，在一些降脂研究中也發(fā)現(xiàn)，膽汁酸結(jié)合劑，如考來烯胺散(消膽胺)、考來替蘭和鹽酸考來維侖[21]，不僅能降低血漿膽固醇水平，還能降低血糖和糖化血紅蛋白的水平，說明一些膽汁酸結(jié)合劑具有治療2型糖尿病及其肝臟并發(fā)癥的潛力[17]。為了進(jìn)一步探究梓醇降糖和改善糖尿病發(fā)癥的機(jī)制，對db/db小鼠肝臟提取物中12種膽汁酸進(jìn)行定量分析，并對其變化情況進(jìn)行分析。梓醇干預(yù)后的糖尿病小鼠肝臟膽汁酸譜發(fā)生顯著變化，下調(diào)甘氨結(jié)合型膽汁酸(甘氨膽酸、甘氨石膽酸)和游離型膽汁酸石膽酸、去氧膽酸與鵝去氧膽酸水平，上調(diào)游離型膽汁酸中膽酸與熊去氧膽酸水平。梓醇干預(yù)后糖尿病小鼠的膽汁酸譜情況趨向正常組而與模型小鼠相反，說明梓醇不僅能降低血糖水平，能通過調(diào)節(jié)肝臟中膽汁酸水平，調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的糖脂代謝紊亂，從而起到降低血糖、提高糖耐受能力和改善其肝損傷等并發(fā)癥的作用。

地黃是一個具有重要藥用價值和經(jīng)濟(jì)效益的藥用植物[22]。本研究探究了地黃中有效成分梓醇的降糖機(jī)制，并觀察了梓醇在改善2型糖尿病肝臟及視網(wǎng)膜損傷方面和調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸方面的作用，發(fā)現(xiàn)梓醇能夠通過調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸代謝發(fā)揮降糖和改善糖尿病并發(fā)癥的藥效活性，為地黃治療糖尿病及其并發(fā)癥提供了理論依據(jù)。