羅 晶，胡 帥，楊標斌，李 信，歐陽玲花，周巾英，袁林峰，祝水蘭*

（1.江西省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，江西 南昌 330200；2.江西省檢驗檢測認證總院 工業(yè)產品檢驗檢測院，江西 南昌 330200）

目前我國富硒稻米的種植面積不斷擴大，但富硒大米深加工仍處于初級加工狀態(tài)，在加工技術和經濟效益上與發(fā)達國家存在很大差距。硒蛋白具有良好的生物活性，主要包括抗氧化活性、免疫調節(jié)、神經保護活性和抑制高血糖活性等［1-3］。硒是人和動物的必需微量元素之一，具有調節(jié)心血管、提高免疫力和抗癌防癌等作用［4］，硒蛋白在人體內發(fā)揮著降低重金屬毒害等特殊生理功能［5］。富硒蛋白是無機硒的潛在替代品，不僅具有蛋白質的結構性質，而且具有硒的理化性質［6］。基于此，開發(fā)一種科學、定量補硒的富硒蛋白粉已成為目前的迫切需求，同時在深加工中減少硒的流失，從而提高富硒稻米的經濟附加值及硒元素的利用率，提升我國稻米深加工的技術水平和綜合利用水平。

目前，硒蛋白的提取方法主要包括溶劑提取（水、鹽、乙醇、酸、酶和堿溶液萃取）、電泳分離萃取、TRIzol結合陰離子交換柱萃取、超聲輔助提取和脈沖電場輔助提取等［7］。梁潘霞等［8］以富硒大米為原料，采用堿提法提取硒蛋白，最佳提取條件為：提取溫度50 ℃、堿液濃度0.14 mol/L、提取時間5 h、料液比1∶30，硒蛋白提取率為57.11%。王克鐵等［9］以米渣磨漿，采用超聲與高壓均質法結合處理，得到蛋白液，濃縮干燥后獲取蛋白粉。Liang等［10］使用100 Hz超聲波清洗器輔助，料液比1∶15的NaOH 0.05 mol/L，DL-二硫蘇糖醇2.5%和0.5%亞硫酸鈉，40 ℃提取4 h，經冷凍干燥，獲得蛋白粉。Wu等［11］比較了4種提取方法（水提取、脈沖電預處理+水提取、超聲輔助提取和脈沖電預處理+超聲輔助提?。Ω晃《罐⒌牡鞍踪|和硒含量的影響，其中超聲輔助提取方法產生的蛋白質純度最高（77%）和總硒含量（9097.33±35.66 mg/kg）。溶劑提取法由于其高效率和低成本而受到廣泛推廣，但是同時也存在著硒蛋白嚴重流失的問題。因此，研究一種高效提取硒蛋白的方法具有廣闊的市場推廣價值。

本研究使用富硒稻米生產中的碎米為主要原料提取硒蛋白。采用超聲波細胞粉碎與堿法聯用提取硒蛋白，并分析其硒形態(tài)。通過配制堿提液來高效斷裂蛋白質分子的二硫鍵，再用酸調等電點使硒蛋白析出沉淀并獲取硒蛋白。此方法解決了缺硒地區(qū)補硒的問題，高效、便捷地提取出了具有高營養(yǎng)價值的碎米硒蛋白，該硒蛋白可用作營養(yǎng)輔料或營養(yǎng)強化劑，具有較高的利用價值。探究了超聲波堿法提取富硒大米中硒蛋白的效果，并獲得提取的最佳工藝條件，為提高硒蛋白資源的開發(fā)利用及增加營養(yǎng)食品的附加值、多樣性和便捷性提供了有力的支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒大米用粉碎機粉碎至全部通過100目篩孔，密封置于干燥器中備用；試驗用水均為超純水；鹽酸、氫氧化鈉采購自國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

使用的實驗儀器設備包括XL-200A型粉碎機（上海潤實電器有限公司）、TP-214型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、UP250型超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、WZJ-12B型超微粉碎儀（濟南天方機械有限公司）、B-260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）、SHA-B型水浴恒溫振蕩器（常州潤華電器有限公司）、LGJ-18真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）、HJ-4B數顯恒溫測速磁力攪拌器（金壇區(qū)金城晶澤實驗儀器廠）、PHS-3C雷磁pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）、SY-3000A型磨粉機（善友機械設備有限公司）、EYELA旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 富硒大米硒蛋白等電點pH值的測定 將富硒大米加工產物碎米粉碎，加入NaOH溶液混勻。采用5000 r/min轉速下離心30 min，使淀粉充分沉淀，分別取出上清液20 mL，放入7個50 mL的小燒杯中用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將燒杯中溶液的pH值分別調節(jié)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。取7個潔凈并已稱質量（m0）的離心管，分別將上述燒杯中的溶液放于離心管中稱量質量（m1），然后在5000 r/min轉速下離心30 min，將上清液小心傾入另一試管中，并測定上清液中的蛋白的質量濃度，同時稱量離心后沉淀與離心管的質量（m），并計算沉淀率，計算公式如下：

1.3.2 富硒大米硒蛋白提取工藝 將富硒大米碎米粉碎得到大米粉末，加入一定量的堿液混勻，經超聲波細胞粉碎儀及磁力攪拌器攪拌一定的時間，所得漿液在5000 r/min轉速下離心30 min，然后將pH值調至等電點4.5，倒出上清液，將沉淀物的pH值調至中性，經冷凍干燥得富硒大米蛋白粉。

1.3.3 單因素試驗 固定超聲波功率190 Hz，料液比1∶8，NaOH濃度0.4%，提取時間2 h。分析不同的超聲波功率（130、160、190、220、250 Hz）、料液質量體積比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）、NaOH濃度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、提取時間（1、2、3、4、5 h）對硒蛋白提取的影響。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計 在單因素試驗的基礎上，應用Design-Expert 8.0.6軟件選擇對硒得率有顯著影響的因素，應用Box-Behnhen設計硒得率為響應值，從中篩選出提取硒蛋白的最優(yōu)條件。響應面因素水平設計如表1所示。

表1 Box-Benhnken試驗設計的因素水平

1.3.4 硒蛋白提取率的計算 上清液中的蛋白質量濃度測定使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒，采用G250染色液試劑比色法。采用酶標儀在波長595 nm處測定吸光度值，再用牛血清蛋白制作標準曲線，并求曲線回歸方程，從而算出總蛋白質含量；硒蛋白質測定采用GB 5009.5—2016食品中的蛋白質的測定；硒含量測定采用氫化物原子熒光光譜法，按照GB 5009.93—2017中的方法測定硒含量。硒得率和硒蛋白提取率的計算公式如下所示：

1.4 數據分析

所有試驗均重復3次，結果取平均值。應用SPSS 24軟件進行Anova和Duncan檢驗，以確定平均值之間的顯著性差異（P＜0.05）；應用Origin 8.6軟件進行數據制圖；應用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 大米硒蛋白等電點的測定

2.1.1 牛血清蛋白的標準曲線 牛血清蛋白質的標準曲線如圖1所示，在標準品濃度0～1.5 mg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

圖1 蛋白標準曲線

2.1.2 大米蛋白質等電點pH值的測定 在等電點pH條件下，蛋白質在溶液中的溶解度最小，產生的沉淀量最大。由圖2可知，在不同pH值條件下，蛋白質含量呈先升高后降低的趨勢。在pH值為5.5條件下的硒蛋白沉淀量較大；pH值為3.5條件下的沉淀率最大（7.0%），且上清液中的蛋白含量達到最低（0.11 mg/mL），硒蛋白的等電點的pH值為3.5。由于等電點條件下的蛋白質分子顆粒在溶液中不存在同電荷的相互排斥作用，其蛋白質分子顆粒極易相互碰撞、凝聚而析出沉淀。因此，在該等電點條件下溶液中蛋白質的溶解度最?。?2］。由本試驗的結果可以得出，硒蛋白的等電點為3.5。

圖2 pH值對富硒大米蛋白含量及沉淀率的影響

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲波功率對大米蛋白提取率及硒得率的影響 在硒蛋白提取過程中，結合超聲波細胞粉碎儀可大幅提高蛋白質的產出率。由圖3可知，隨著超聲波功率升高，硒蛋白提取率先升高后降低。當超聲波功率為220 Hz時，硒蛋白提取率為50.6%，硒得率為98.17%；在超聲波功率為250 Hz時，硒蛋白提取率為49.91%，硒得率為99.43%。因此，當超聲波功率為220 Hz時，硒蛋白提取率最高。這說明超聲波通過機械效應、空化效應和熱效應提取蛋白質，可顯著促進蛋白質的溶解，從而提高蛋白質的提取速率［13］。加大超聲波功率，可強化超聲空化作用和機械剪切作用，有助于大米蛋白的溶出。但隨著功率增加，上述作用效應會出現負效應，如當功率達220 Hz后，硒蛋白提取率出現了略微下降。綜上，設定220 Hz為最適的超聲波功率。

圖3 超聲波功率對硒蛋白提取率及硒得率的影響

2.2.2 料液比對大米蛋白得率及硒得率的影響 由圖4可知，硒蛋白提取率和硒得率隨料液比增大呈先增后降的趨勢，當料液比為1∶10時，硒蛋白提取率和硒得率最大，分別為50.93%、99.86%。當液料比較低時，提取液的黏度較大，分子擴散速率較低，蛋白分子的溶出速率較低，且蛋白質量濃度較高，分子間的相互斥力會阻礙更多蛋白的溶出［14］。隨著液料比的增加，稀釋作用加強，提取液的黏度和蛋白質量濃度均有所下降，蛋白的溶出增加，提取率升高。當料液比為1∶10條件下，蛋白能夠充分析出，此時蛋白收率達到最大。當繼續(xù)增大料液比時，溶液中蛋白質濃度較低，泡沫穩(wěn)定性較差，蛋白質得率降低［15］。

圖4 料液比對硒蛋白提取率及硒得率的影響

2.2.3 堿濃度對大米蛋白提取率及硒得率的影響 由圖5可知，隨著堿濃度增加，硒蛋白提取率與硒得率呈先增后降趨勢。當堿濃度為0.4%時，硒蛋白提取率和硒得率最大，分別為49.36%、99.43%。大米蛋白在胚乳中與淀粉結合緊密，較難溶出。NaOH能夠有效提高蛋白的溶解性，其可以破壞蛋白分子中的二硫鍵、氫鍵和酰胺鍵，使蛋白質的溶解性上升，提高了蛋白質的提取產率［16］。當堿濃度超過0.4%后，由于淀粉部分糊化，使溶液黏度增加，導致蛋白無法被提取出來，蛋白提取率下降。因此最適的堿濃度為0.4%。

圖5 堿濃度對硒蛋白提取率及硒得率的影響

2.2.4 提取時間對大米蛋白提取率及硒得率的影響 由圖6可知，隨著提取時間的增加，硒蛋白提取率與硒得率均呈先增后降趨勢。當提取時間為2 h時，硒蛋白提取率和硒得率最大，分別為55.74%、99.98%。提取時間較長和過高濃度的堿液會使得蛋白質的半胱氨酸和絲氨酸結合形成賴丙氨酸，導致營養(yǎng)物質損失［17］。因此使用超聲波細胞粉碎儀和磁力攪拌器輔助，可縮短堿液提取時間，降低堿液濃度，提高硒蛋白提取率。當提取時間超過2 h時，出現了蛋白質凝聚沉積現象，導致了蛋白提取率降低［18］。

圖6 提取時間對硒蛋白提取率及硒得率的影響

2.3 響應面試驗結果分析

從單因素試驗的結果可得，超聲波功率220 Hz、料液比1∶10 g/mL、堿濃度0.4%、提取時間2 h分別為各單因素下的最佳提取硒蛋白條件。在單因素的基礎上，以硒蛋白的提取率為評價指標，對超聲波功率、料液比、堿濃度、提取時間進行四因 素三水平的響應面優(yōu)化設計，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.3.1 回歸方程及參數分析 通過Design-Expert 8.05軟件對表2的試驗結果進行數據擬合，得到二次多元回歸方程：

Y=57.44+1.55A+1.15B+1.13C-1.18D-0.35AB+ 1.15AC-1.50AD+1.38BC+1.34BD+0.013CD-2.96A2-4.19B2-8.52C2-3.73D2。

該模型的顯著性分析見表3，由方差分析結果可知，模型F=89.16，該回歸模型P＜0.0001，說明該回歸差異極顯著；方程失擬項F=3.46、P＞0.05，表明失擬項對純誤差的影響不顯著；該模型的決定系數（R2）為0.9778，校正決定系數（R2adj）為0.9409，說明該回歸方程與試驗擬合度良好，其他因素對試驗結果的干擾??；根據F值可知，影響富硒大米蛋白提取率的4個因素的大小順序依次為堿濃度、料液比、超聲功率、提取時間；根據P的變化可知，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、BC和AD對硒蛋白提取率影響極顯著（P＜0.01）。

表3 顯著性分析

續(xù)表3：

2.3.2 提取工藝優(yōu)化及驗證試驗結果 應用Design-Expert 8.06軟件分析得出大米蛋白提取的最佳工藝參數為：堿濃度0.14%、料液比1∶10、超聲波功率220 Hz、提取時間2 h。該條件下大米硒蛋白提取率為57.44%，對優(yōu)化參數進行了3次重復驗證試驗，得大米硒蛋白提取率為57.95%，與預測值非常接近，證實了該回歸模型用于提取大米硒蛋白具有較高的可靠性。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，運用響應面分析法對富硒大米蛋白的提取條件進行優(yōu)化。各因素對大米蛋白得率的主次因素為：NaOH濃度＞料液比＞超聲功率＞提取時間，驗證試驗進一步得到在超聲波功率220 Hz，堿液濃度0.4%，提取時間2 h，料液比1∶10條件下，大米硒蛋白提取率達到57.95%。本試驗結果可為規(guī)?；崛〈竺孜鞍滋峁﹨⒖迹淅砘再|還有待進一步深入研究。