李秀萍，王春雨，唐 艷，劉德穩(wěn)，高 晨，吳秀芬，李衛(wèi)東，李冬梅，于運峰,胡元亮

(1.德州學院生態(tài)與資源環(huán)境學院，山東德州 253000；2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京 210095)

淫羊藿又名三枝九葉草，為小檗科植物柔毛淫羊藿、箭葉淫羊藿或心葉淫羊藿的干燥地上部分，味辛、甘,性溫，入肝、腎經(jīng)，有強筋骨、祛風濕、溫腎壯陽的功效。臨床主治母畜不發(fā)情、寒濕痹痛等。淫羊藿的主要成分有黃酮、多糖、生物堿、蒽醌類、萜類、微量元素等，多糖作為其主要有效成分之一，因為其廣闊而顯著的藥用價值成為現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿多糖具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫活性、抗氧化等生物活性[1]。

板藍根為十字花科植物菘藍的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有清熱解毒、涼血利咽等功能，臨床上常用于病毒及細菌感染性疾病[2-3]。近年來，隨著人們對多糖生物活性和特殊藥用功能認識的進一步加深，板藍根多糖被認為是板藍根生物活性和特殊藥用功能的主要作用因子之一。因此，關于板藍根多糖的研究越來越引起研究人員的重視。

本試驗在之前研究的基礎上[4-5]，用水煎醇沉法提取淫羊藿多糖和板藍根多糖，Sevag法除蛋白后用DEAE-52柱層析分離，得到初步純化的淫羊藿多糖(Epimediumpolysaccharides,EPS1和 EPS2)和板藍根多糖(Isatisroot polysaccharides,IRPS1和IRPS2)，并對淫羊藿多糖EPS1和板藍根多糖IRPS1進行了沉淀溶解試驗和紅外光譜鑒定，旨在初步探討這兩種多糖的制備和理化性質，為進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用藥物 淫羊藿飲片和板藍根飲片，購自南京金陵大藥房。淫羊藿飲片，安徽濟人有限公司產(chǎn)品，批號12067；板藍根飲片，徐州彭祖中藥飲片公司產(chǎn)品，批號12067。

1.1.2 主要試劑 D(+)-葡萄糖，分析純，中國惠興生化試劑有限公司產(chǎn)品；苯酚，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；無水乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、氯仿、正丁醇均為分析純，上海試劑一廠產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 FA1104N型電子天平、754型紫外分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；真空干燥箱，上海精宏試驗設備有限公司產(chǎn)品；L-550型離心機，湖南湘儀試驗儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；101A-1E型電熱鼓風干燥箱，層析柱(2 cm×80 cm)，上海試驗儀器有限公司產(chǎn)品；BA-100A型自動部分收集器、HL-2B型數(shù)顯恒流泵、TH-1000型梯度混合器，上海滬西分析儀器有限公司產(chǎn)品；Scietz-12N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；75-2A型微量振蕩器，上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品；透析袋，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；DEAE-52柱層析填料，Whatman進口分裝產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 淫羊藿多糖和板藍根多糖的提取 稱取淫羊藿2 kg，加950 mL/L乙醇蒸餾30 min，加20倍水武火煮沸，文火維持1 h，煎煮2次，合并濾液濃縮至2 000 mL。室溫緩慢加乙醇至80%，靜置24 h，取沉淀加蒸餾水2 000 mL溶解，靜置過夜，取上清加乙醇至80%，靜置24 h，取沉淀真空干燥，得淫羊藿粗多糖(grossEpimediumpolysaccharide,EPSg)，稱重，計算多糖提取率。

多糖提取率(%)=多糖質量(g)/淫羊藿飲片質量(g)×100%。

取板藍根2 kg，加950 mL/L乙醇蒸餾3次，晾干，加10倍水浸泡2 h，煮沸，以下提取同上，得板藍根粗多糖(grossIsatisroot polysaccharide IRPSg)，稱重，計算多糖提取率。

多糖提取率(%)= 多糖質量(g)/板藍根飲片質量(g)×100%。

1.2.2 淫羊藿多糖和板藍根多糖的分離 Sevag法去蛋白：將上述所得2種多糖加適量蒸餾水60 ℃水浴使完全溶解，加入1/5體積氯仿，1/25體積正丁醇，振搖20 min，3 500 r/min離心20 min，取水相重復上述操作7次～8次，旋轉蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥，得去蛋白多糖。

DEAE-52纖維素離子交換層析：將處理后的DEAE-52 纖維素裝柱(1.6 cm×50 cm)，取去蛋白多糖加蒸餾水溶解成100 mg/mL，離心，取上清液50 mL上柱，淫羊藿多糖以0.1 mol/L NaCl、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫，板藍根多糖以蒸餾水、0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，控制洗脫速度為1 mL/min，分管收集，每管5 mL，用苯酚-硫酸法檢測至無糖檢出。以洗脫管數(shù)為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線。合并單一峰洗脫液，濃縮、冷凍干燥，得初步純化的淫羊藿多糖(EPS1和EPS2)和板藍根多糖(IRPS1和IRPS2)。

1.2.3 淫羊藿多糖和板藍根多糖的鑒定

1.2.3.1 糖含量測定 用改良的硫酸-苯酚法。

標準曲線的繪制:精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖25 mg，加適量蒸餾水溶解并定容至50 mL，作為對照品溶液。精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液2 mL，置具塞試管中，分別加50 mL/L苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃H2SO45.0 mL，搖勻，在沸水浴中保溫15 min，取出冷卻至室溫，以相應試劑為空白，用分光光度儀測定490 nm處的吸光度值。以對照品濃度(x)為橫坐標，吸光度(y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程(y=Ax+b)和R2值。

樣品含量測定:將待測樣品經(jīng)105 ℃干燥至恒重，精密稱取10 mg加適量蒸餾水溶解并定容至50 mL，精密量取2 mL置具塞試管中，按標準曲線的操作方法測定各樣品吸光度y值，將平均y值求數(shù)后代入回歸方程，計算多糖含量

1.2.3.2 沉淀溶解試驗 分別取淫羊藿多糖EPS1 pH為9的收集液和板藍根多糖IRPS1 pH為10的收集液各10 mL，分別用50 mL/L鹽酸滴定，待沉淀完全再用20 mg/mL NaOH溶液回滴，觀察溶解情況。

1.2.3.3 紅外光譜測定 取適量KBr初步研磨后，其放在紫外燈下烘干1 h～2 h，加適量多糖混勻，研磨成極其細小的粉粒，做成透明均勻的壓片，用Nicolet FT-IR200型傅里葉變換紅外光譜儀記錄4 000/cm～400/cm范圍內(nèi)的紅外光譜[6-7]。

2 結果

2.1 淫羊藿多糖和板藍根多糖的提取和分離

2種多糖的得率、糖含量見表1。淫羊藿2 kg經(jīng)水煎醇沉法獲得淫羊藿粗多糖EPSg 84.69 g，得率為4.24%，糖含量為21.35%；DEAE-52纖維素層析洗脫得到2個峰(圖1)，分別收集2個峰得到2個純化的淫羊藿多糖EPS1和EPS2，其多糖含量分別為53.1%和37.34%。標準曲線的回歸方程為y=15.28x+0.017 2，R2=0.999 3。

圖1 淫羊藿多糖的DEAE-52纖維素離子交換洗脫曲線

表1 兩種多糖的得率和糖含量

板藍根飲片2 kg經(jīng)水煎醇沉法獲得板藍根粗多糖IRPSg 104.76 g，得率為5.24%，糖含量為34.76%；DEAE-52纖維素柱層析洗脫得到2個峰(圖2)，分別收集2個峰得到2個純化的板藍根多糖IRPS1、IRPS2，其多糖含量分別為97.92%和30.85%。

圖2 板藍根多糖的DEAE-52纖維素離子交換洗脫曲線

2.2 淫羊藿多糖和板藍根多糖的沉淀溶解差異

分別取收集液淫羊藿多糖EPS1和收集液板藍根多糖IRPS1各10 mL，用50 mL/L鹽酸滴定，收集液淫羊藿多糖EPS1出現(xiàn)顆粒狀沉淀，收集液板藍根多糖IRPS1出現(xiàn)絮狀沉淀；用20 mg/mL NaOH溶液回滴，EPS1的顆粒狀沉淀不溶解，IRPS1的絮狀沉淀可以溶解。結果表明，EPS1與IRPS1的理化性質不同。

2.3 淫羊藿多糖和板藍根多糖的紅外光譜

EPS1和IRPS1的紅外光譜見圖3和圖4，2種糖的紅外光譜顯示一些糖的特征性振動峰：EPS1在3 387.74/cm、IRPS1在3 363.16/cm處有一強且寬的吸收峰，為O-H鍵的伸縮振動；EPS1在1 642.52/cm、IRPS1在1 637.89/cm處有一吸收峰，為-C=O的伸縮振動；在1 400/cm～1 000/cm處為C-H、C-O和C-C振動吸收峰。

圖4 IRPS1的紅外光譜

3 討論

考慮到糖苷鍵的理化性質，多糖的提取過程應避免過熱、酸、堿等因素以及避免浸提過程中染菌。經(jīng)乙醇沉淀后可得到粗多糖，為得到更純的多糖，需再脫色和脫蛋白處理，脫蛋白方法常用Sevag法或蛋白酶法等[8]，本試驗采用了對多糖組成成分影響較小的Sevag法。在提取分離過程中，根據(jù)不同的原料，選擇浸提工藝和技術參數(shù)也不相同，本試驗中，淫羊藿和板藍根都采用了2次浸提，淫羊藿因含色素在提取前需進行脫色處理，板藍根因脂類成分較多則需進行脫脂處理。淫羊藿2 kg經(jīng)水煎醇沉法獲得淫羊藿粗多糖EPSg 84.69 g，得率為4.24%，多糖含量為21.35%；Sevag法去蛋白、DEAE-52纖維素離子交換層析后，得到2個純化的淫羊藿多糖EPS1、EPS2，其多糖含量分別為53.1%和37.34%。板藍根飲片2 kg經(jīng)水煎醇沉法獲得板藍根粗多糖IRPSg 104.76 g，得率為5.24%；板藍根粗多糖IRPSg的多糖含量為34.76%；Sevag法去蛋白、DEAE-52纖維素離子交換層析后，得到2個純化的板藍根多糖IRPS1、IRPS2，其多糖含量分別為97.92%和30.85%。初步純化后，IRPS1的得率1.98%大于EPS1得率1.53%；IRPS1多糖的含量97.92%大于EPS1多糖含量53.1%。

離子交換層析法是通過載體表面帶電基團與樣品離子和洗脫液所帶電荷離子進行可逆交換、離子偶極作用和離子吸附實現(xiàn)分離的。不同多糖尤其是多糖與蛋白質結合的復合多糖，采用不同鹽濃度的洗脫液洗脫，根據(jù)多糖所帶電荷的差異而達到分離的目的[9]。本試驗中酸性淫羊藿多糖與陰離子交換劑DEAE-52纖維素的結合更為牢固，板藍根多糖更容易被洗脫。淫羊藿多糖我們以0.1 mol/L、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫，板藍根多糖以蒸餾水、0.1 mol/L NaCl溶液洗脫。用0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，得到的淫羊藿多糖EPS1吸光度最高，為1.6；在其他條件相同的條件下，用蒸餾水洗脫，板藍根多糖IRPS1吸光度最高，為3。

糖的紅外光譜顯示，EPS1和IRPS1均具有3 600/cm～3 000/cm、3 000/cm～2 800/cm、1 400/cm～1 200/cm多糖特征吸收峰。3 300/cm和2 900/cm左右的特征吸收峰分別是由-OH和-CH2基團中C-H的伸縮振動引起的[10]。EPS1中吡喃環(huán)的C-O-C的伸縮振動使紅外圖譜出現(xiàn)1 150.24/cm的特征吸收峰[11]。1 025.51/cm吸收峰的存在說明多糖含有吡喃糖環(huán)內(nèi)酯鍵。EPS1中852.40/cm特征吸收峰說明EPS1中存在α-糖苷鍵。1 404.68/cm處的特征吸收峰是-COOH中的COO-伸縮振動引起的；-COOH中-OH的伸縮振動引起1 243.84/cm處的特征吸收峰[12]，此結果與酸性多糖結果一致[13]。在IRPS1中，1 035.63/cm處的強吸收峰證明單糖以吡喃糖苷的形式存在，在1 637.89/cm處吸收峰是C=O的非對角伸縮振動吸收引起，在1 230/cm處沒有中強吸收峰，即沒有S=O對稱伸縮振動的特征峰，表明組分IRPS1中不含糖醛酸[14]。

淫羊藿多糖與板藍根多糖的組成和理化性質不完全相同。