李宏雅，紀(jì) 鵬，魏彥明，買占海，張曉松，周 軻，武凡琳，趙年壽，華永麗，姚萬玲，袁子文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

近些年來，呼吸系統(tǒng)疾病是畜禽高發(fā)的三大類疾病之一，多反復(fù)發(fā)病，且病死率較高。病因主要為畜禽抵抗力差外加病邪入侵。中獸醫(yī)理論認(rèn)為，此類疾病應(yīng)屬于“氣虛”，主要因肺氣虛或脾肺氣虛、衛(wèi)表不固、外邪乘虛而入所致。其防治法則為益肺健脾、扶正祛邪。針對此類疾病，提升畜禽免疫力甚為重要。玉屏風(fēng)是主治畜禽氣虛自汗的經(jīng)典名方[1]，能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能、降低炎性因子水平、提高抗變態(tài)反應(yīng)能力[2]，四君子散是主治脾胃氣虛證的經(jīng)典名方[1]，有研究表明加味四君子湯能提高機(jī)體免疫功能、造血功能與抗應(yīng)激能力[3]?；谖逍欣碚摗芭嗤辽稹狈▽烧吆嫌米裱恕拔床∠确?，既病防變”“正氣存內(nèi)，邪不可干”等中獸醫(yī)預(yù)防疾病理念。合方是方劑加減變化重要形式之一[4]，而方劑精簡又是中獸藥現(xiàn)代發(fā)展的重要理念。依據(jù)中獸藥創(chuàng)新思路，參考前期研究結(jié)果[5]，形成自擬組方加味玉屏風(fēng)(Jiawei Yupingfeng，JWYPF)。多糖是中藥中發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用的重要活性成分，一直是中藥活性成分研究的熱點(diǎn)之一。本試驗(yàn)旨在研究加味玉屏風(fēng)和加味玉屏風(fēng)多糖(Jiawei Yupingfeng polysaccharides，JWYPF-P)對小鼠免疫抑制的干預(yù)效果，以期為加味玉屏風(fēng)在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 90只4周齡SPF級雄性昆明小鼠，體重20 g±2 g，購自蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號[SCXK(甘)2020-0002]，晝夜各半循環(huán)照明，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始試驗(yàn)。動物試驗(yàn)獲得甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥材與試劑 黃芪、炒白術(shù)、黨參、炙甘草等加味玉屏風(fēng)組方藥材，購自蘭州市黃河藥材批發(fā)市場，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)教研室魏彥明教授鑒定。黃芪多糖(Lol#G2028113)，Shanghai Macklin Biochemical Co.Ltd公司產(chǎn)品；注射用環(huán)磷酰胺，德國Baxter公司產(chǎn)品；小鼠sIgA、IgG、IgM ELISA試劑盒(Lot06/2021)，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品；CD3+-PE、CD4+-FITC、CD8+-APC單克隆抗體，美國Biolegend公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 ZHT-Ⅰ型自動恒溫電熱套，山東省鄄城縣永興儀器廠產(chǎn)品；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；血常規(guī)分析儀，Boule Medical AB公司產(chǎn)品；Spectra Max Plus384酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司產(chǎn)品；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、自動組織脫水機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 JWYPF及其粗多糖的制備 按照自擬加味玉屏風(fēng)的組成比例配制成JWYPF，并按前期優(yōu)化試驗(yàn)方法制備多糖：料液比1∶10，回流提取1.5 h后過濾，濾渣加10倍蒸餾水回流提取1 h，合并濾液，濃縮，冷凍干燥，得JWYPF干浸膏；取濃縮液加入3倍體積無水乙醇，靜置12 h后離心20 min取沉淀，冷凍干燥，制得JWYPF粗多糖。

1.2.2 JWYPF-P純化 取1.2.1所得JWYPF粗多糖，參照文獻(xiàn)[6]報道的方法對JWYPF粗多糖進(jìn)行除蛋白。參照文獻(xiàn)[7]報道的方法對JWYPF粗多糖進(jìn)行脫色，即得JWYPF精制多糖。

1.2.3 免疫抑制小鼠模型的建立 小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)80 mg/kg，連續(xù)3 d，建立免疫抑制模型。若小鼠出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，被毛粗亂，且血常規(guī)檢測顯示模型小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板數(shù)目明顯降低，說明建模成功。

1.2.4 動物分組及給藥 將90只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性對照組、JWYPF-P低、中、高劑量組(0.125、0.250、0.500 mg/g)、JWYPF低、中、高劑量組(0.815、1.63、3.26 mg/g)，每組10只?？瞻讓φ战M和模型組灌服生理鹽水，陽性對照組(100 mg/kg)給予黃芪多糖[8]，低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)8 d，第5～第7天，除空白對照組注射生理鹽水外，其余各組腹腔注射CTX(80 mg/kg)制備免疫抑制小鼠模型。

1.2.5 動物處理與樣本采集

1.2.5.1 一般體征觀察 觀察試驗(yàn)期間小鼠精神狀態(tài)，并記錄體重，給藥結(jié)束后，采血并對小鼠胸腺和脾臟稱重，計算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量)。

1.2.5.2 血常規(guī)檢查 檢測小鼠血液中白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、單核細(xì)胞(MON)、中性粒細(xì)胞(GRA)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)等指標(biāo)。

1.2.5.3 免疫球蛋白測定 用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中的sIgA、IgG、IgM含量。

1.2.5.4 病理組織學(xué)檢查 取胸腺、脾臟于100 mL/L福爾馬林溶液中固定，采用梯度乙醇脫水，石蠟包埋，蘇木精-伊紅(HE)染色后鏡下觀察。

1.2.5.5 脾臟CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的檢測 無菌條件下分離脾臟，制備脾臟單細(xì)胞懸液，在含1×106個細(xì)胞體系中染色，加入CD16/32(1∶200)封閉抗體，依次加入PE-CD3、APC-CD8、FITC-CD4抗體，避光孵育30 min。用PBS洗滌，離心后棄去上清，加入PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 一般體征觀察

與空白對照組相比，第5天開始造模后，模型組小鼠表現(xiàn)精神沉悶、被毛凌亂，采食量下降，小鼠的體重明顯下降。與模型組相比，JWYPF-P給藥組和JWYPF給藥組小鼠精神狀態(tài)及被毛凌亂有所緩解，體重下降趨勢變緩(圖1)。

2.2 胸腺、脾臟臟器指數(shù)變化

與空白對照組相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均明顯降低(P<0.01)，表明小鼠免疫抑制模型建立成功。與模型組相比，JWYPF和JWYPF-P給藥組小鼠胸腺指數(shù)均有升高，其中JWYPF-P高劑量組顯著升高(P<0.01)；JWYPF給藥組脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.05或P<0.01)(表1)。

表1 各組小鼠胸腺、脾臟臟器指數(shù)比較

2.3 血常規(guī)指標(biāo)變化

與空白對照組相比，模型組小鼠血液中的WBC、LYM、MON、GRA、RBC、PLT均明顯降低(P<0.01或P<0.05)，結(jié)合前期一般體征變化分析，表明小鼠免疫抑制模型建立成功。與模型組相比，JWYPF和JWYPF-P給藥組的WBC、LYM、MON、GRA、PLT升高，其中JWYPF-P中劑量組WBC、LYM、MON、GRA明顯升高(P<0.05或P<0.01)；JWYPF低劑量和JWYPF-P低、中劑量組RBC明顯升高(P<0.05或P<0.01)；JWYPF-P中劑量和JWYPF中、高劑量組PLT明顯升高(P<0.05或P<0.01)(圖2)。

a.WBC；b.LYM；c.MON；d.GRA；e.RBC；f.PLT;K.空白對照組；M.模型組；Y.陽性對照組；PD.JWYPF-P低劑量組；PZ.JWYPF-P中劑量組；PG.JWYPF-P高劑量組；D.JWYPF低劑量組；Z.JWYPF中劑量組；G.JWYPF高劑量組;與空白對照組相比，# P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 血清sIgA、IgG、IgM水平變化

與空白對照組相比，模型組的小鼠血清中sIgA、IgG、IgM降低，其中IgG極顯著下降(P<0.01)，表明小鼠免疫抑制模型建立成功。與模型組比較，JWYPF-P中劑量組sIgA顯著升高(P<0.05)，JWYPF給藥組與JWYPF-P高劑量sIgA恢復(fù)至正常水平，但差異不顯著(P>0.05)；JWYPF和JWYPF-P各劑量組IgG明顯提高(P<0.01)；JWYPF-P各劑量組以及JWYPF高劑量組IgM明顯升高(P<0.01)，表明JWYPF及其多糖均能恢復(fù)降低的免疫球蛋白水平，JWYPF-P的效果優(yōu)于JWYPF(表2)。

表2 各組小鼠血清中免疫球蛋白sIgA、IgG、IgM水平的比較

2.5 脾臟、胸腺的病理組織學(xué)變化

與空白對照組相比，模型組小鼠脾臟組織中淋巴細(xì)胞稀疏，間質(zhì)纖維大量增生，脾臟組織中動脈周圍淋巴鞘變薄以及脾小結(jié)減少，白髓和紅髓間界限模糊；經(jīng)JWYPF及其多糖干預(yù)后，上述病變均有一定緩解，表現(xiàn)為間質(zhì)纖維增生減少，動脈周圍淋巴鞘增厚，脾小結(jié)增多等(圖3)。相比于空白對照組，模型組胸腺組織皮質(zhì)、髓質(zhì)界限模糊，小梁消失，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞減少，胸腺小體減少；經(jīng)JWYPF及其多糖干預(yù)后，上述病理損傷得到不同程度的緩解，皮質(zhì)、髓質(zhì)分界明顯清晰，胸腺小體增加，且JWYPF及其多糖具有量效關(guān)系(圖4)。

a.空白對照組；b.模型組；c.陽性對照組；d.JWYPF-P低劑量組；e.JWYPF-P中劑量組；f.JWYPF-P高劑量組；g.JWYPF低劑量組；h.JWYPF中劑量組；i.JWYPF高劑量組；RP.紅髓；WP.白髓；←.動脈周圍淋巴鞘

a.空白對照組；b.模型組；c.陽性對照組；d.JWYPF-P低劑量組；e.JWYPF-P中劑量組；f.JWYPF-P高劑量組；g.JWYPF低劑量組；h.JWYPF中劑量組；i.JWYPF高劑量組；C.皮質(zhì)；M.髓質(zhì)；←.胸腺小體

2.6 脾臟CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量比例與CD4+/CD8+比值的變化

與空白對照組相比，模型組的CD3+T細(xì)胞數(shù)量比例極顯著降低(P<0.01)，CD4+T細(xì)胞的數(shù)量比例以及CD4+/CD8+比值降低(P>0.05)；與模型組相比，陽性對照組以及JWYPF-P高劑量組CD3+T細(xì)胞數(shù)量比例均顯著升高(P<0.05)，而JWYPF高劑量組增高但無顯著差異(P>0.05)；CD4+T細(xì)胞數(shù)量比例也增高，其中JWYPF-P高劑量組顯著升高(P<0.05)；CD4+/CD8+比值JWYPF-P高劑量組極顯著升高(P<0.01)(表3)。

表3 各組小鼠脾臟CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量比例與CD4+/CD8+比值比較

3 討論

環(huán)磷酰胺是目前常用的建立免疫抑制模型的免疫抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺是通過抑制骨髓造血干/祖細(xì)胞，引起白細(xì)胞減少癥，從而導(dǎo)致動物免疫功能受到抑制[9-10]，其作用范圍廣泛，對細(xì)胞免疫、體液免疫均有抑制作用。CTX經(jīng)灌胃和腹腔注射均可建立小鼠免疫抑制模型，但后者操作簡便、周期短、特異性高。因此，本研究選用連續(xù)3 d腹腔注射80 mg/kg CTX建立小鼠免疫抑制模型，結(jié)果顯示，造模后小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)量明顯下降，白細(xì)胞分型數(shù)量比例發(fā)生紊亂，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著下降，小鼠脾臟中CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量比例顯著降低，證實(shí)經(jīng)CTX建模后，小鼠整體免疫水平下降，這與以往研究報道相符[11-12]。

白細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，檢測白細(xì)胞的數(shù)量和比例是評估免疫功能高低的有效指標(biāo)[13]。胸腺和脾臟中含有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，因此胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)被作為衡量機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。T淋巴細(xì)胞主要分為輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD4+)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD8+)，有研究發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+T細(xì)胞比值處于動態(tài)平衡狀態(tài)，可以反映動物機(jī)體的細(xì)胞免疫水平[14]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，JW-YPF及其多糖給藥組小鼠體重、胸腺及脾臟指數(shù)均有所升高，小鼠的WBC、LYM、MON、PLT的數(shù)量也有提升，病理損傷緩解，提示提前用JWYPF及其多糖干預(yù)小鼠對CTX所致的免疫抑制有一定的緩解作用。經(jīng)藥物干預(yù)后，CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量比例、CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均有提高，提示其可能通過提高機(jī)體細(xì)胞免疫水平來對抗CTX所致的損傷，這與前期的相關(guān)報道一致[15-16]。

slgA、IgG與IgM是反映機(jī)體體液免疫水平的主要指標(biāo)。slgA又稱分泌型免疫球蛋白，是腸黏膜表面的免疫屏障。IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，占比約70%，是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體。IgM在體內(nèi)產(chǎn)生最早，持續(xù)時間較短，在抗感染免疫早期起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，JWYPF及其多糖均可顯著提高免疫抑制小鼠血清中IgG、IgM水平，但對sIgA水平影響不顯著，這與馮丹等[8]報道一致。且JWYPF-P不同劑量干預(yù)免疫抑制小鼠體液免疫功能效果優(yōu)于JWYPF，表明JWYPF-P的效果優(yōu)于JWYPF。

綜上所述，JWYPF及其多糖均能緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制，且JWYPF-P的效果優(yōu)于JWYPF。其機(jī)制可能是通過增加WBC數(shù)量，提升脾臟中CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量比例以及血清中sIgA、IgG、IgM含量，增強(qiáng)小鼠的免疫功能。本研究結(jié)果為加味玉屏風(fēng)在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。