沈 煜，張皓杰，張文娟，王麗榮，蔡秀磊*，單 虎

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；2.山東碧藍(lán)生物科技有限公司，山東泰安 271411)

近年來，隨著動(dòng)物養(yǎng)殖模式的集約化和規(guī)?；l(fā)展，養(yǎng)殖密度大大增加，動(dòng)物疫病的傳播和流行也隨之加劇。細(xì)菌感染作為動(dòng)物疫病中的重要組成部分，往往極易引發(fā)混合感染或繼發(fā)感染[1]。長期以來應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染主要依靠抗生素治療，但生產(chǎn)中抗生素濫用現(xiàn)象十分普遍，帶來了嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問題[2]，尤其是多重耐藥菌株的增加，不僅使臨床治療失敗的現(xiàn)象增多，而且不規(guī)范用藥也使得動(dòng)物性食品中的藥物殘留超標(biāo)[3]，既影響了動(dòng)物性食品的出口、威脅到社會(huì)公共衛(wèi)生安全，又破壞了健康養(yǎng)殖生態(tài)平衡和自然中的微生物生態(tài)平衡[4]，不符合健康可持續(xù)發(fā)展的理念。隨著我國“禁抗令”[5]的頒布和實(shí)施，含有飼用抗生素的飼料全面停售，養(yǎng)殖業(yè)的“后抗生素”時(shí)代全面來臨，尋找新的抗生素替代品以保障養(yǎng)殖安全變得尤為重要。海洋微生物以其豐富的生物多樣性日益受到關(guān)注[6]，目前已有大量的海洋源細(xì)菌被報(bào)道具有抑菌活性，且已鑒定的抑菌活性代謝產(chǎn)物約600余種[7]。細(xì)菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)[8]是細(xì)菌個(gè)體之間信息交流的主要工具，在調(diào)控細(xì)菌毒力因子的表達(dá)、耐藥性方面發(fā)揮重要作用。密度感應(yīng)淬滅則通過淬滅細(xì)胞間的信號(hào)分子，阻斷病原菌之間的交流，從而有效干擾致病菌毒力因子的表達(dá)，降低甚至消除致病菌的致病性。本研究通過對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)其抑菌活性與密度感應(yīng)淬滅活性，可為后續(xù)更好地開展對(duì)該菌及其抑菌活性產(chǎn)物的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 報(bào)告菌紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)CV026和VIR24，大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)E1、E2、E3、E4株，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)PMJ4-1、PMJ10-1、PMJ30-2、TTB1-1、TTB2-1、QTB1-1株，沙門氏菌(Salmonella)QS1株，鏈球菌(Streptococcus)SS-1、SS-2、SS-7、SS-9株，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA1、PA2株，志賀氏菌(Shigellacastellani)T3株，鰻弧菌(Vibrioanguillarum)VIB72，河流弧菌(Vibriofluvialis)VIB292，東方弧菌(Vibrioorientalis)VIB303，哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)VIB295，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)FYB01，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 2216E海洋細(xì)菌培養(yǎng)基，美國BD公司上海有限公司產(chǎn)品；rTaq酶，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine lactones,AHL)信號(hào)分子C6-HSL、3-oxo-C6-HSL、C8-HSL，美國開曼生物公司產(chǎn)品；AHL信號(hào)分子3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL，美國西格瑪化學(xué)品公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)基和瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素(Amp)10 μg、卡那霉素(Kan)30 μg和四環(huán)素(Tet)30 μg藥敏片，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 高壓滅菌鍋(MLS-3751L)，日本松下公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；全溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-FX)和生物安全柜(BSC-1100-LIA2)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；PCR儀(T100),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；核酸電泳(JY600)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；核酸電泳凝膠成像系統(tǒng)(GenoSens1850),上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化及形態(tài)學(xué)觀察 將新鮮的健康斑節(jié)對(duì)蝦產(chǎn)品樣品進(jìn)行研磨、稀釋后，涂布于海洋細(xì)菌培養(yǎng)基2216E平板上，28 ℃恒溫過夜培養(yǎng)獲得若干菌株。將分離所得的菌株進(jìn)一步純化培養(yǎng)后，挑取各菌株的單菌落點(diǎn)種于涂有鰻弧菌VIB72的平板上，28 ℃過夜培養(yǎng)。能在平板上產(chǎn)生抑菌圈的菌株命名為DL1，并進(jìn)行革蘭氏染色與鏡檢。

1.2.2 菌株DL1的16S rRNA的擴(kuò)增與測(cè)序 將菌株DL1劃線接種于2216E斜面，28 ℃培養(yǎng)過夜后，取2 mL滅菌雙蒸水洗滌菌苔并收集于離心管中，高速離心棄去上清液，收集菌體沉淀。采用酚-氯仿抽提法[9]提取菌株DL1的基因組總DNA作為PCR反應(yīng)模板，以27F/1492R通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得的16S rRNA核苷酸序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blastn進(jìn)行序列比對(duì)，應(yīng)用序列綜合分析軟件MEGA5.1中Clustal W比對(duì)后，用phylogeny以NJ、ML和MP法構(gòu)建菌株DL1的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間的生物量、抑菌活性、胞外蛋白含量 取20 μL復(fù)蘇后的菌液DL1轉(zhuǎn)接至2 mL 2216E液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(28 ℃、170 r/min)，在培養(yǎng)24、48、72、96 h后，分別用酶標(biāo)儀測(cè)定OD 600 nm值，并以牛津杯法測(cè)定各樣品對(duì)VIB72的抑菌活性強(qiáng)弱；將各個(gè)時(shí)期收集的菌液低溫高速條件下離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)收集上清液，經(jīng)0.22 μm孔徑濾器除菌后，測(cè)定不同樣品的OD 595 nm值，以表征各樣品中蛋白的含量。

1.2.4 抑菌試驗(yàn) 用牛津杯法測(cè)定菌株DL1對(duì)23株常見病原菌的抑制效果。23株病原菌經(jīng)活化后分別接種于LB和2216E液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過夜后，將待測(cè)菌液與LB半固體培養(yǎng)基混合(比例1∶100)倒板，每孔中添加DL1菌液50 μL。培養(yǎng)24 h后測(cè)量菌株DL1對(duì)不同病原菌所產(chǎn)生的透明圈直徑[11]，同時(shí)檢測(cè)陽性對(duì)照抗生素(Amp、Kan和Tet)藥敏紙片的抑菌效果。

1.2.5 密度感應(yīng)淬滅活性檢測(cè) 采用平板檢測(cè)法測(cè)DL1對(duì)不同AHL類信號(hào)分子的淬滅活性。報(bào)告菌CV026和VIR24分別用于檢測(cè)短鏈(C4～C8)和長鏈(C8～C14)AHL信號(hào)分子，報(bào)告菌接種于LB培養(yǎng)基并28 ℃培養(yǎng)活化后備用。將培養(yǎng)好的DL1菌液、PIPES緩沖液(1 mol/L，pH 6.7)以及AHL類信號(hào)分子(1 mmol/L)按10∶1∶0.1的比例混勻后[12]，在28 ℃孵育24 h，即為制備的反應(yīng)液。報(bào)告菌按3%接種量加入到溫度為45 ℃左右的半固體LB培養(yǎng)基中，迅速混勻后倒板，待凝固后在板上打孔，取上述反應(yīng)液10 μL加入檢測(cè)孔，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照(ddH2O、PIPES緩沖液與各類信號(hào)分子按比例10∶1∶0.1配置)，正置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察藍(lán)色或紫色暈圈的出現(xiàn)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 T-text用于兩組之間的比較，使用One-Way ANOVA進(jìn)行多次比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)定“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)，“ns”表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA序列分析

分離菌株在2216E培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)48 h，菌落呈黃色，邊緣整齊、光滑，革蘭氏陰性桿菌，端生鞭毛。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后獲得一段1 444 bp長的序列，測(cè)序結(jié)果用Blastn進(jìn)行比對(duì)，該基因與金麗假交替單胞菌(Pseudoalteromonasflavipulchra)NCIMB 2033T同源性高達(dá)100%，用序列綜合分析軟件MEGA5.1對(duì)菌株DL1與相近菌株的16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)，結(jié)果顯示菌株DL1與金麗假交替單胞菌(P.flavipulchra)NCIMB 2033T親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株DL1鑒定為金麗假交替單胞菌。

●.該節(jié)點(diǎn)與采用ML、MP法的結(jié)果一致；○.該節(jié)點(diǎn)與采用ML法的結(jié)果一致

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間生物量、抑菌活性及胞外蛋白的含量結(jié)果

由圖2A可知，菌株DL1的生物量在48 h、72 h和96 h極顯著高于24 h(P<0.01)，48 h極顯著高于72 h(P<0.01)，48 h和72 h極顯著高于96 h(P<0.01)，菌株DL1在培養(yǎng)48 h后，其生物量到達(dá)最高值，隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長生物量開始下降，這表明培養(yǎng)48 h時(shí)，菌株DL1已經(jīng)進(jìn)入了生長穩(wěn)定期，此時(shí)菌的數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定并達(dá)到最高水平。圖2B可知，菌株DL1對(duì)VIB72的抑菌活性在48 h、72 h和96 h極顯著高于24 h(P<0.01)，48 h極顯著高于72 h(P<0.01)，48 h和72 h極顯著高于96 h(P<0.01)，48 h時(shí)該菌對(duì)VIB72的抑菌活性最強(qiáng)。對(duì)其不同培養(yǎng)時(shí)間的胞外產(chǎn)物中蛋白含量的影響，由圖2C可知，48 h、72 h和96 h極顯著高于24 h(P<0.01)，48 h極顯著高于72 h(P<0.01)，48 h和72 h極顯著高于96 h(P<0.01)。培養(yǎng)48 h時(shí)胞外產(chǎn)物中蛋白的含量達(dá)到最高，隨后蛋白濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而顯著降低。因此，確定在后續(xù)開展對(duì)該菌的抑菌活性檢測(cè)及活性產(chǎn)物分離純化時(shí)，均采用培養(yǎng)48 h這個(gè)培養(yǎng)條件。

A.不同培養(yǎng)時(shí)間的生物量；B.不同培養(yǎng)時(shí)間胞外產(chǎn)物的抑菌圈；C.不同培養(yǎng)時(shí)間的胞外蛋白總量

2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

采用牛津杯法檢測(cè)菌株DL1對(duì)23株常見病原菌的抑菌活性，結(jié)果顯示菌株DL1對(duì)其中的21株病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑在10 mm以上。其中，菌株DL1對(duì)金黃色葡萄球菌PMJ4-1、QTB1-1、TTB2-1的拮抗作用最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌TTB1-1、鰻弧菌VIB72、東方弧菌VIB303的拮抗作用次之，但是對(duì)金黃色葡萄菌PMJ30-2和鏈球菌SS-2無抑菌效果，具體結(jié)果見表1。本研究中采用的Amp、Kan和Tet藥敏紙片均無法抑制本試驗(yàn)中的所有病原菌，表明這23株病原菌均具有一定的耐藥性，菌株DL1對(duì)指示菌的抑菌強(qiáng)度明顯強(qiáng)于所用的藥敏紙片，可見菌株DL1具有較為廣泛的抑菌活性。

表1 菌株DL1對(duì)不同病原菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.4 密度感應(yīng)淬滅活性檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)檢測(cè)孔與陽性對(duì)照孔的顯色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株DL1對(duì)本試驗(yàn)中所用到的AHL類信號(hào)分子均具有淬滅活性(圖3)。其中，菌株DL1對(duì)3-oxo-C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL具有非常強(qiáng)的淬滅活性，其檢測(cè)孔完全不顯色，與陽性對(duì)照對(duì)比非常明顯；而對(duì)3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL的淬滅活性相對(duì)較弱，未完全淬滅該信號(hào)分子，檢測(cè)孔仍可見模糊的紫色；菌株DL1對(duì)C6-HSL的淬滅活性較弱，雖然檢測(cè)孔的紫色暈圈直徑略有縮小，但仍有非常明顯的紫色顯示，表示檢測(cè)孔中仍有大量的C6-HSL未被淬滅。

(+).ddH2O、PIPES緩沖液與各類信號(hào)分子所配置的反應(yīng)液

3 討論

假交替單胞菌是20世紀(jì)90年代由Gaulthier等[13]首次報(bào)道的一個(gè)屬，該屬細(xì)菌已經(jīng)有游海假交替單胞菌、檸檬假交替單胞菌、金麗假交替單胞菌等41個(gè)種被鑒定[14]。已有研究結(jié)果顯示該屬細(xì)菌的多個(gè)種均具有較強(qiáng)的抑菌活性，可以在不同的環(huán)境中保持競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，因此廣泛存在于海洋深處、極地等環(huán)境中。假交替單胞菌能產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，主要包括生物堿、聚酮類、肽[15]、胞外酶[16]和胞外多糖[17]等。

本研究對(duì)分離純化的菌株DL1進(jìn)行了16S rRNA核苷酸序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定為金麗假交替單胞菌。抑菌活性結(jié)果顯示，菌株DL1可以廣泛抑制本試驗(yàn)中所檢測(cè)的90%以上的動(dòng)物病原菌，且抑菌活性明顯強(qiáng)于3種抗生素；經(jīng)密度感應(yīng)淬滅活性檢測(cè)，菌株DL1對(duì)短鏈和長鏈AHL類信號(hào)分子均具有較強(qiáng)的密度感應(yīng)淬滅活性，尤其是對(duì)3-oxo-C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL等信號(hào)分子的淬滅活性較強(qiáng)。此前，于敏[18]報(bào)道金麗假交替單胞菌JG1具有抑菌活性和密度感應(yīng)淬滅活性，本試驗(yàn)結(jié)果與之相似，且自菌株JG1中分離鑒定了5種小分子抑菌化合物和密度感應(yīng)淬滅酶PfaP，系統(tǒng)闡述了JG1的抑菌機(jī)制。Wang H等[19]發(fā)現(xiàn)了1株金麗假交替單胞菌CDM8，對(duì)多種弧菌和芽孢桿菌具有較好的抑菌活性，經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌可以在外表面形成囊狀/絲狀結(jié)構(gòu)，參與了其抑菌活性，是CDM8的一種新的抗菌機(jī)制。至今，關(guān)于金麗假交替單胞菌的密度感應(yīng)淬滅活性相關(guān)報(bào)道甚少?；诰闐L1的抑菌活性和密度感應(yīng)淬滅活性檢測(cè)結(jié)果，該菌具有作為有益菌應(yīng)用的潛質(zhì)，可以進(jìn)一步開展該菌株及其活性代謝產(chǎn)物的應(yīng)用研究。

本研究分離得到的金麗假交替單胞菌DL1具有較強(qiáng)的抑菌活性和密度感應(yīng)淬滅活性，今后可以對(duì)菌株的活性產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和重組表達(dá)，深入開展該菌及其產(chǎn)物的功能和應(yīng)用研究，探索其在動(dòng)物細(xì)菌性病害防控中的應(yīng)用途徑和策略。