李 程，田向?qū)W，李秀麗*，邱大勇，任衛(wèi)科，趙 陽，李富強(qiáng)，高旭盟，董志民，孟恒星

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)天津科學(xué)觀測實驗站，天津 300381；3.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津 300381；4.天津奧康普尼生物醫(yī)藥科技有限公司，天津 300381)

隨著肉雞集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，因飼養(yǎng)密度增加而導(dǎo)致的生產(chǎn)應(yīng)激不斷上升，導(dǎo)致肉雞免疫功能下降。同時，一些細(xì)菌性因素包括支原體、大腸埃希氏菌感染等，病毒性疾病如雞新城疫、禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥和傳染性法氏囊病等，以及營養(yǎng)不良、抗菌藥物濫用等因素，也會造成肉雞的免疫系統(tǒng)受到破壞引起免疫抑制[1]。因此，如何提高肉雞自身免疫力在養(yǎng)雞生產(chǎn)中受到日益關(guān)注。多肽是一類由氨基酸以肽鍵連接在一起的化合物，聚合度小，分子大小處于蛋白質(zhì)與氨基酸之間的位置。已有研究報道，多肽類制劑在提高動物生產(chǎn)性能、提高疫苗免疫效果、增強(qiáng)動物機(jī)體免疫和抗應(yīng)激能力方面有良好的作用，而且不會對機(jī)體造成損害和殘留[2-5]。多肽制品的研制和推廣應(yīng)用對促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色發(fā)展，保障人類健康有著深遠(yuǎn)的意義。通常，單一的多肽氨基酸不夠平衡，復(fù)合多肽則能實現(xiàn)不同蛋白質(zhì)中氨基酸的互補(bǔ)。已有研究表明，復(fù)合多肽制劑能夠提高肉雞的生產(chǎn)性能、抗病能力及成活率[6-8]。復(fù)合膠原蛋白肽、人工合成活性肽和復(fù)合小肽等產(chǎn)品對肉雞生長和免疫能力也有良好的效果[9-11]。

家禽具有哺乳動物沒有的氣囊，不論吸氣還是呼氣，家禽肺內(nèi)均可進(jìn)行氣體交換。肉雞通過呼吸吸入霧滴，使得多肽與雞的眼、口、鼻、上呼吸道、肺和氣囊直接接觸。這種呼吸結(jié)構(gòu)可擴(kuò)大擴(kuò)散面積，增加吸收量。禽的肺泡面積大，且含有豐富的毛細(xì)血管，使得多肽得以廣泛分布并迅速被吸收。且能避免對胃腸道產(chǎn)生負(fù)擔(dān)，多肽也不必參與肝腎代謝[12-13]。在人類治療研究中，早已有肺部給藥的先例，以避免胃酸和小腸堿性環(huán)境的干擾[14]。在實際生產(chǎn)中，噴霧操作比較簡單、省時省力，使得噴霧給藥在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用越來越廣泛。本研究采用舍內(nèi)噴霧的方式將復(fù)合多肽制劑用于肉雞生產(chǎn)，探索其對肉雞免疫功能的影響，為復(fù)合多肽制劑在肉雞養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用制劑 噴霧用復(fù)合多肽制劑(細(xì)胞培養(yǎng)溶液經(jīng)過分子篩和濃縮等技術(shù)獲得的多種生物活性物質(zhì)，含有多肽、氨基酸、細(xì)胞因子等多種活性成分)，天津欣普賽爾生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品(生產(chǎn)批號：XLA20082801，XLB20082801)。

1.1.2 主要試劑 雞新城疫病毒血凝抑制試驗抗原、陽性血清，哈爾濱國生生物股份有限公司產(chǎn)品；雞白細(xì)胞介素(interleukin，IL)4、IL-6、IL-10、補(bǔ)體C3(complement 3，C3)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品；雞新城疫疫苗，北京信得威特科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗用雞及飼料 1日齡“科寶”肉雛雞，北京大豐家禽有限公司產(chǎn)品；育雛料和育成料，天津大成飼料有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 氣溶膠冷霧化彌霧機(jī)(1 L)，山東聚誠五里霧環(huán)境科技有限公司產(chǎn)品；BioTek 405LS洗板機(jī)、BioTek ElX800酶標(biāo)儀，美國寶特公司產(chǎn)品；臺式超速冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；高速臺式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；電子天平，華志電子科技有限公司產(chǎn)品；微量移液器，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

1.2.1.1 試驗用動物的飼養(yǎng) 試驗共占用4間面積及規(guī)格相同的雞舍，雞舍應(yīng)用自動化控溫設(shè)備控制雞舍溫濕度。肉雞采用網(wǎng)上平養(yǎng)的方式，相同條件下隔離飼養(yǎng)，自由采食飲水，飼養(yǎng)期為42 d。各組試驗雞經(jīng)滴鼻點眼方式免疫接種雞新城疫活疫苗，首免日期為7日齡，二免日期為21日齡。

1.2.1.2 試驗分組 選擇1日齡健康科寶肉雞120只，隨機(jī)分為4組(Ⅰ組～Ⅳ組)，每組30只，每組設(shè)3個重復(fù)。Ⅰ組為低劑量組(0.05 mL/只)、Ⅱ組為中劑量組(0.1 mL/只)、Ⅲ組為高劑量組(0.15 mL/只)、Ⅳ組空白對照組。對3組試驗雞采用噴霧給藥方式添加不同濃度的復(fù)合多肽制劑，空白對照組添加相同劑量生理鹽水進(jìn)行噴霧。

1.2.1.3 給藥方法 將復(fù)合多肽制劑原液用去離子水按照一定比例進(jìn)行稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用，分別于6日齡和13日齡對各組肉雞進(jìn)行舍內(nèi)噴霧。2次噴霧給藥劑量按照實際體重比例進(jìn)行分配，按1周齡科寶肉雞平均體重180 g左右，2周齡科寶肉雞平均體重500 g左右計算(數(shù)據(jù)來源北京大豐客戶養(yǎng)殖科寶雞實際平均體重)。6日齡受試品添加量為添加總量的25%，13日齡受試品添加量為添加總量的75%。Ⅳ組(空白對照組)采用生理鹽水噴霧(表1)。

表1 復(fù)合多肽制劑工作液配制表

1.2.1.4 噴霧前關(guān)閉Ⅰ組～Ⅳ組試驗雞舍的空調(diào)及排風(fēng)扇，用氣溶膠冷霧化彌霧機(jī)噴霧，持續(xù)10 min，之后封閉30 min，然后打開空調(diào)和排風(fēng)扇通風(fēng)。噴霧的水溫控制在22 ℃～25 ℃。肉雞6日齡、13日齡各噴霧1次。

1.2.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.2.1 雞新城疫病毒抗體效價測定 試驗雞于7、14、21、28、35、42日齡，每組各隨機(jī)選擇20只試驗雞翅靜脈采血，測定血清中的雞新城疫病毒HI抗體效價。

1.2.2.2 免疫器官指數(shù)測定 試驗雞于21日齡(每個組各選擇5只)和42日齡(每個組各選擇10只)，進(jìn)行空腹稱重。頸靜脈放血處死，分離胸腺、脾臟和法氏囊，剔除脂肪組織，用濾紙吸干分別稱重，計算免疫器官指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺重(g)/試驗雞活重(kg)；

脾臟指數(shù)=脾臟重(g)/試驗雞活重(kg)；

法氏囊指數(shù)=法氏囊重(g)/試驗雞活重(kg)。

1.2.2.3 血清中細(xì)胞因子指標(biāo)測定 試驗雞于7、14、21日齡，每組各隨機(jī)選擇20只試驗雞翅靜脈采血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心3 min，分離血清分裝于200 μL EP管中，置-20 ℃保存。所有樣品采集完成之后，應(yīng)用ELISA測定血清中IL-4、IL-6、IL-10和C3含量。

1.2.3 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 2.0軟件對各組試驗雞進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，試驗結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合多肽對肉雞新城疫病毒抗體水平的影響

從表2可以看出，14、21、28日齡時，復(fù)合多肽低劑量組的肉雞血清中新城疫病毒抗體滴度顯著高于空白對照組(P<0.05)。21日齡和28日齡時，中劑量組的肉雞血清中新城疫病毒抗體水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。結(jié)果說明舍內(nèi)噴霧低劑量的復(fù)合多肽(0.05 mL/只)在14、21、28日齡對肉雞新城疫病毒抗體水平有明顯的增強(qiáng)作用。在35日齡和42日齡時，各組間肉雞抗體水平無顯著差異(P>0.05)。

表2 復(fù)合多肽對肉雞新城疫病毒抗體滴度的影響

2.2 復(fù)合多肽對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表3可知，在21日齡和42日齡，與空白對照組相比，低、中、高劑量噴霧添加復(fù)合多肽對肉雞的法氏囊系數(shù)、脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)都無見顯著影響(P>0.05)。

表3 復(fù)合多肽對肉雞免疫器官系數(shù)的影響

2.3 復(fù)合多肽對肉雞細(xì)胞因子的影響

試驗期肉雞血清中細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10和C3水平測定結(jié)果見表4～表7。表4結(jié)果顯示，7日齡時，低、中、高各組肉雞血清中IL-4含量均顯著高于空白對照組(P<0.05)，血清中IL-4含量隨著給藥劑量增加逐漸升高。14日齡和21日齡，低、中、高各組肉雞血清中IL-4含量與空白對照組相比未見顯著差異(P>0.05)，表明舍內(nèi)噴霧復(fù)合多肽制劑在7日齡對肉雞血清中IL-4含量有明顯的上調(diào)作用且與給藥劑量呈正相關(guān)。

表4 復(fù)合多肽對肉雞血清中IL-4含量的影響

從表5中可以看出，7日齡和14日齡空白對照組肉雞血清中IL-6含量均為最高，7日齡空白對照組肉雞血清中IL-6含量顯著高于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，14日齡空白對照組肉雞血清中IL-6含量顯著高于中劑量組和高劑量組(P<0.05)。21日齡高劑量組肉雞血清中IL-6含量最高，高劑量組肉雞血清中IL-6含量均顯著高于空白對照組和中劑量組(P<0.05)，與低劑量組相比差異不顯著。結(jié)果表明，舍內(nèi)噴霧復(fù)合多肽制劑對肉雞血清中IL-6含量在7日齡和14日齡有明顯下調(diào)作用。但是在21日齡這種作用不明顯。

表5 復(fù)合多肽對肉雞血清中IL-6含量的影響

從表6中可以看出，7日齡雞群中，各劑量組IL-10與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。14日齡時，空白對照組肉雞血清中IL-10含量最高，顯著高于中劑量組和高劑量組(P<0.05)。在21日齡階段，空白對照組肉雞血清中IL-10含量最高，顯著高于其他各試驗組(P<0.05)。表明舍內(nèi)噴霧復(fù)合多肽制劑對肉雞血清中IL-10含量在14日齡和21日齡有明顯下調(diào)作用。

表6 復(fù)合多肽對肉雞血清中IL-10含量的影響

表7結(jié)果表明，7日齡各試驗組肉雞血清中補(bǔ)體C3含量與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。14日齡空白對照組肉雞血清中補(bǔ)體C3含量最高，顯著高于其他各試驗組(P<0.05)。21日齡肉雞血清中補(bǔ)體C3含量各組之間差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，舍內(nèi)噴霧復(fù)合多肽可降低14日齡肉雞血清中補(bǔ)體C3含量，但對7日齡和21日齡肉雞血清中補(bǔ)體C3含量沒有影響。

表7 復(fù)合多肽對肉雞血清中補(bǔ)體C3含量的影響

3 討論

畜禽生產(chǎn)中，已有添加復(fù)合多肽、復(fù)合小肽、生物活性肽等制品來降低料重比，提高動物特異性免疫與非特異性免疫的案例。其作用機(jī)理目前尚不清楚，但作為免疫調(diào)節(jié)劑已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。通過識別和清除異己物質(zhì)、與其他系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)，共同維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定和平衡[7]。禽類的免疫系統(tǒng)是隨著種系的發(fā)展過程逐漸形成的，負(fù)責(zé)防御有害物質(zhì)對禽類機(jī)體的侵害。當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，免疫細(xì)胞對抗原進(jìn)行識別，啟動免疫細(xì)胞活化、增殖及分化。產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)將抗原排除，從而抵抗病原微生物的侵害[15]。

目前，對雞群危害最嚴(yán)重的還是病毒性疾病，且尚無有效的治療辦法，最主要的手段還是采取疫苗防疫。但是各種因素導(dǎo)致的雞群免疫抑制大大降低了疫苗的免疫效果。以新城疫病毒抗體滴度作為反映機(jī)體體液免疫反應(yīng)水平的指標(biāo)，用于復(fù)合多肽制劑對肉雞特異性免疫能力的評估。結(jié)果顯示，舍內(nèi)噴霧復(fù)合多肽制劑具有改善機(jī)體免疫機(jī)能，增強(qiáng)疫苗免疫效果的作用。在14日齡～28日齡，以低劑量和中劑量噴霧添加復(fù)合多肽制劑都明顯提高了抗體的滴度。高劑量的添加沒有增強(qiáng)肉雞的體液免疫反應(yīng)，說明在低、中劑量噴霧添加復(fù)合多肽制劑能更好地提高機(jī)體接種疫苗后的免疫保護(hù)。但是在35日齡～42日齡，各試驗組與空白對照組抗體水平差異不顯著。推測是由于2次噴霧均在試驗前期，時間分別為6日齡和13日齡。而多肽在體內(nèi)能夠被較快吸收[16]，在試驗后期復(fù)合多肽通過機(jī)體的吸收、轉(zhuǎn)化和代謝，其提高免疫功能作用可能有所減弱。因此，復(fù)合多肽在肉雞體內(nèi)的代謝規(guī)律有待進(jìn)一步的研究，對復(fù)合多肽制劑在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用有一定的指導(dǎo)意義。

法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)是評價肉雞免疫水平的重要指標(biāo)，可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。一般認(rèn)為免疫器官指數(shù)降低為免疫抑制所致[17]。復(fù)合多肽制劑的添加并未導(dǎo)致免疫器官指數(shù)降低，說明舍內(nèi)噴霧復(fù)合多肽制劑不會造成機(jī)體發(fā)生免疫抑制。

復(fù)合多肽噴霧可以通過肉雞的呼吸作用進(jìn)入呼吸道，除了對肉雞特異性免疫和免疫器官發(fā)育有影響之外，對非特異性免疫功能也可能會存在調(diào)節(jié)作用。輔助T細(xì)胞是調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，其功能活躍區(qū)分為輔助型T細(xì)胞1(T helper 1，Th1)和輔助型T細(xì)胞2(T helper 2，Th2)兩個細(xì)胞亞群[18]。Th1細(xì)胞支持細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞驅(qū)動體液免疫應(yīng)答。IL-4主要由Th2細(xì)胞表達(dá)，主要調(diào)節(jié)體液免疫[19]，是評價免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)。IL-6可由多種細(xì)胞合成，可激活T細(xì)胞，活化B細(xì)胞增殖分化并產(chǎn)生抗體，在介導(dǎo)免疫應(yīng)答過程中有重要的作用。IL-10在機(jī)體平衡細(xì)菌、真菌、原生動物、蠕蟲和病毒感染引起的炎癥反應(yīng)中起重要作用[20]。其活性作用開始于促炎免疫反應(yīng)后，通過抑制免疫反應(yīng)調(diào)控很多促炎因子的表達(dá)，并與病毒的持續(xù)性感染有關(guān)[21]。禽類的IL-10的功能與哺乳動物十分相似[22]。C3是血清中含量最高的補(bǔ)體成分，主要有巨噬細(xì)胞和肝臟合成，在C3轉(zhuǎn)化酶的作用下，裂解成C3a和C3b兩個片段，在補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中均發(fā)揮重要作用。舍內(nèi)噴霧復(fù)合多肽各劑量組在7日齡提高肉雞血清中的IL-4含量，且呈劑量依賴性，同時下調(diào)IL-6的在血清中的蛋白表達(dá)水平。在14日齡各劑量組持續(xù)下調(diào)IL-6作用，但是到21日齡下調(diào)不再明顯。14日齡和21日齡，各劑量組肉雞血清中IL-10下調(diào)的作用最為明顯。說明復(fù)合多肽制劑對肉雞血清中IL-4、IL-6和IL-10均有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。試驗過程中7日齡和21日齡復(fù)合多肽對肉雞血清中C3含量無顯著影響，只有中間的14日齡的變化不太規(guī)律。整體來看，使用復(fù)合多肽進(jìn)行舍內(nèi)噴霧在提高疫苗抗體水平的同時基本不影響血清補(bǔ)體C3的含量。

綜上所述，復(fù)合多肽制劑能夠調(diào)節(jié)肉雞的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，其中以0.05 mL/只添加復(fù)合多肽制劑上調(diào)肉雞新城疫病毒抗體水平效果最好。7日齡各劑量組肉雞血清中IL-4含量顯著升高且與給藥劑量正相關(guān)。各劑量組14日齡和21日齡對IL-10抑制作用效果顯著。