任海燕，劉旭東，趙 莉，郝智慧，劉志海*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830000；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100089；3.青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院，山東青島 266109)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是一種常見的革蘭氏陰性細菌，它具有分布面廣、分離率高、傳播途徑多樣等特點。在畜禽養(yǎng)殖和人類生活中，大腸埃希氏菌常通過糞便排泄等傳播途徑造成人類或動物細菌性疾病。最易引起大腸桿菌病，病原為禽致病性大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)[1]，包括引起皮膚、生殖系統(tǒng)和普通呼吸道(氣囊炎)感染以及嚴重的心包炎、肝周炎、輸卵管炎、臍炎、敗血癥等。這些疾病的發(fā)生，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成了巨大的阻礙[2]。大腸埃希氏菌作為耐藥基因及質(zhì)粒傳播的載體，已經(jīng)成為耐藥基因傳播擴散的儲存庫，導致了細菌耐藥譜范圍不斷擴大，多重耐藥形勢愈加嚴峻，這給該菌引起的感染性疾病防治帶來了困難與挑戰(zhàn)[3]；更嚴重的是，現(xiàn)有研究表明畜禽源耐藥大腸埃希氏菌正在通過從養(yǎng)殖場到餐桌的食物鏈條傳遞給人類，給人類健康安全帶來了威脅。山東作為禽肉產(chǎn)業(yè)大省，畜禽養(yǎng)殖數(shù)量大，患病風險高，同時由于抗菌藥物的不規(guī)范使用，細菌耐藥性問題愈發(fā)嚴重。因此，了解山東青島地區(qū)禽源大腸埃希氏菌的細菌耐藥現(xiàn)狀和流行特點，對疾病防治具有重要意義。本研究以2019年11月在青島養(yǎng)殖場中采集的185份雞泄殖腔拭子作為研究對象，通過細菌分離鑒定、藥敏試驗、耐藥基因檢測等試驗，對分離的173株菌株進行耐藥流行特點分析，研究結(jié)果對獸醫(yī)臨床指導用藥、預防和控制雞源大腸桿菌病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 采集山東省青島地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場雞泄殖腔拭子共185份，藥敏試驗質(zhì)控菌株(標準菌株ATCC 25922)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 麥康凱、Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×TaqMaster Mix(Dye Plus)、DNA Marker(DL 2 000)，南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；Gold view核酸染料，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；亞胺培南(imipenem,IMP)、美羅培南(meropenem,MEM)、阿莫西林(amoxicillin,AMX)、頭孢氨芐(cefalexin,CN)、頭孢他啶(ceftazidime,CAZ)、頭孢噻肟(cefotaxime,CTX)、頭孢吡肟(cefepime,FEP)、多黏菌素E(colistin,CT)、四環(huán)素(tetracycline,TCY)、替加環(huán)素(tigecycline,TGC)、慶大霉素(gentamicin,GEN)，武漢威得利化學科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產(chǎn)品；WGZ-2XJ細菌濁度儀，上海昕瑞儀器儀表有限公司產(chǎn)品；G180DS立式高壓蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司產(chǎn)品；Blue pard生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離及種屬鑒定 2019年9月至12月期間，隨機采集雞泄殖腔拭子樣本185份。將樣品置于LB肉湯中，37 ℃孵育18 h，再劃線于麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h～24 h后，挑選單克隆(粉紅色可疑菌落)富集培養(yǎng)，純化后菌株采用煮沸法提取細菌DNA模板，通過16S rRNA，PCR擴增后，將陽性產(chǎn)物送去測序，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫比對鑒定。16S rRNA引物為27F:5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3′，目的片段長度約1 500 bp。PCR 反應參數(shù)：94 ℃ 5min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；(72 ℃5 min。運行反應體系為30 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq聚合酶15 μL，ddH2O補齊至30 μL。

1.2.2 藥敏試驗 采用美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的判定標準[4]，使用瓊脂稀釋法測定11種抗菌藥物對大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，以大腸埃希氏菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.3 耐藥基因檢測 對分離得到的173株大腸埃希氏菌用PCR檢測5類共23種常見耐藥基因，分別為碳青霉烯類(blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaKPC)；β-內(nèi)酰胺類(blaCTX-M)；AmpC-β內(nèi)酰胺酶類(blaDHA、blaACC)；黏菌素類(mcr-1～5)和四環(huán)素類(tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetM、tetO、tetQ、tetX)，引物信息根據(jù)表1參考文獻中對應的試驗條件，確定瓊脂糖凝膠電泳條件(瓊脂糖濃度、電壓及運行時間等)，PCR產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)上觀察記錄條帶位置并拍照。

表1 耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌分離鑒定結(jié)果

185份泄殖腔拭子樣本在麥康凱培養(yǎng)基上分離純化，將疑似樣本經(jīng)16S rRNA測序比對后，共分離出173株大腸埃希氏菌,分離率為93.50%。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

173株大腸埃希氏菌對11種抗菌藥物的藥物敏感性結(jié)果顯示，所有分離株對阿莫西林、頭孢氨芐和四環(huán)素均耐藥，耐藥率100.00%；對頭孢吡肟、頭孢噻肟、慶大霉素、多黏菌素E和頭孢他啶耐藥率較高，依次為84.40%(n=146)、83.20%(n=144)、79.80%(n=138)、75.70%(n=131)、61.30%(n=106)；對亞胺培南、美羅培南和替加環(huán)素的耐藥率相對較低，分別為9.80%(n=17)、7.50%(n=13)、0.58%(n=1)(圖1)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，所有分離菌株均表現(xiàn)多重耐藥，以耐7種和8種抗菌藥物的菌株為主，占比率分別為22.54%和32.94%，最多耐10種抗菌藥物(7.51%)(表2)。

表2 173株大腸埃希氏菌多重耐藥情況

圖1 173株大腸埃希氏菌耐藥結(jié)果

2.3 耐藥基因檢測

173株大腸埃希氏菌對5類23種抗菌藥物耐藥基因檢測結(jié)果見圖2。碳青霉烯類耐藥基因blaNDM檢出率為7.50%(13/173)；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M檢出率為96.00%(166/173)；AmpC-β內(nèi)酰胺酶類耐藥基因blaACC檢出率較低，為4.60%(8/173)；四環(huán)素類耐藥基因tetA檢出率高達90.80%(157/173)，其次為tetM和tetB，檢出率依次為15.30%(26/173)和3.50%(6/173)；黏菌素類耐藥基因mcr-1檢出率為37.90%(66/173)，其他耐藥基因均未檢測出，分離菌株部分基因電泳條帶見圖3。

圖2 雞源耐藥大腸埃希氏菌耐藥基因檢出結(jié)果

A.blaACC;B.blaCTX-M;C.blaNDM;D.tetA;E.mcr-1;M.DNA 標準DL 2 000;+.陽性對照;-.陰性對照;1～7.分離菌株

2.4 耐藥基因共存情況分析

檢出的7種耐藥基因在雞泄殖腔中的共存情況見表3，在173株大腸埃希氏菌中，有4個菌株含有最多5個耐藥基因，組合形式為tetA-tetM-mcr-1-blaCTX-M-blaACC和tetA-tetM-mcr-1-blaCTX-M-blaNDM，占檢測樣本的2.31%；有76個菌株含有2個耐藥基因，占檢測樣本43.93%，有72個菌株含有3個耐藥基因，占檢測樣本41.62%，其中tetA-mcr-1-blaCTX-M為最常見耐藥基因組合形式；只含有1種耐藥基因的樣本有11份，為blaCTX-M和tetB，占檢測樣本的6.36%。

表3 173株大腸埃希氏菌耐藥基因共存情況及耐藥基因譜型

3 討論

本次研究從禽養(yǎng)殖場采集185份拭子，最終分離出大腸埃希氏菌173株(分離率為93.50%)，與先前報道的山東菏澤地區(qū)雞場分離率96.67%、泰安地區(qū)90.00%結(jié)果基本一致[1]，進一步說明了山東地區(qū)雞源耐藥大腸埃希氏菌的流行率較高。

藥敏試驗顯示，本研究在養(yǎng)雞場分離得到的173株大腸埃希氏菌呈現(xiàn)多重耐藥性，11種抗菌藥物的耐藥率為0.58%～100.00%，耐藥情況較為嚴重。盲目使用抗菌藥物是造成細菌耐藥的罪魁禍首，抗菌藥物對病原菌產(chǎn)生選擇性壓力，病原菌耐藥率比例上升。本研究中的所有大腸埃希氏菌呈現(xiàn)多重耐藥，并且菌株主要為7種～8種藥物的多重耐藥，這與秦春芝等[9]表述的多藥耐藥現(xiàn)象一致，耐藥性較為嚴重的有阿莫西林、頭孢氨芐和四環(huán)素，頭孢吡肟、頭孢噻肟、慶大霉素、多黏菌素E和頭孢他啶的耐藥也比較高，這也與已報道的河北省肉雞養(yǎng)殖場和山西病雞禽源大腸埃希氏菌耐藥性研究的結(jié)果較為一致[10-11]，說明不同地區(qū)的禽源大腸埃希氏菌的多藥耐藥情況已呈現(xiàn)普遍趨勢。

此外，禽源大腸埃希氏菌中貯存的耐藥基因，使抗菌藥物的治療效果一再降低[12]。本研究中四環(huán)素類耐藥基因以tetA檢出為主(90.75%)，黏菌素類以mcr-1為主(37.90%)，這與一項青島地區(qū)報道的結(jié)果相同[13]，表明tetA和mcr-1是造成四環(huán)素類和黏菌素類耐藥的主要原因。mcr-1和碳青霉烯類耐藥基因的共同傳播引起了廣泛關(guān)注，本研究檢測到了多株mcr-1與blaNDM共存的菌株，先前國內(nèi)也有報道檢出了mcr-1+blaNDM的革蘭氏陰性菌，這與我們的結(jié)果也相一致[14-15]。研究中還發(fā)現(xiàn)了1株tetA-tetM-mcr-1-blaCTX-M-blaNDM耐藥基因共存的菌株，3株tetA-tetM-mcr-1-blaCTX-M-blaACC共存菌株，說明在同一株菌株中，可存在同時介導β內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、黏菌素類、四環(huán)素類的多種耐藥基因，反映了青島地區(qū)雞養(yǎng)殖場中耐藥基因傳播的復雜性和組合多樣性。另外，tetA-mcr-1-blaCTX-M是本次研究中占比較高的耐藥基因譜，也是其他多種基因組合的基礎基因譜型，這提醒我們在養(yǎng)殖場中應密切關(guān)注重視這3種基因的流行情況及耐藥情況，從而合理規(guī)范用藥。此次研究對青島地區(qū)耐藥基因情況進行了初步檢測，為下一步深入探究blaCTX-M和blaNDM具體分型和耐藥傳播機制提供方向。

針對本研究結(jié)果，建議不同的養(yǎng)殖場對大腸埃希氏菌的藥物敏感性應進行動態(tài)監(jiān)測，健全抗菌藥物耐藥監(jiān)測體系，闡明耐藥基因的儲存和傳播方式，因地制宜的進行治療與防范，才能最大程度減少耐藥菌。除此之外，多種藥物聯(lián)合治療，使用中藥制劑與抗菌藥物的交替使用，對目前防治抗菌藥物單用而產(chǎn)生耐藥性已產(chǎn)生了較好的效果[16-17]。建立大腸埃希氏菌耐藥基因的快速檢測，及時跟進和豐富不同地區(qū)的耐藥流行數(shù)據(jù)庫，也是減少禽類疾病發(fā)生的重點手段之一。