丁渲攀，崔 曉，張西君，達舉云，史金蓮,張 勇

(甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院/甘肅省動物生殖生理及繁殖調控重點實驗室，甘肅蘭州 730070)

馬子宮內膜炎是母馬常見的疾病之一，其發(fā)病率在20%～60%之間[1-3]，不僅會影響母馬正常生理功能，還會導致母馬繁殖障礙甚至終身不孕，在馬場常發(fā)疾病中本病被排在第三位(前兩位依次為馬的呼吸道疾病和馬的胃腸道疾病)，對馬的養(yǎng)殖會造成較大損害[4-6]。細菌性感染是引起馬子宮內膜炎的一個重要原因[7]，目前國內對此病進行相關方面的研究報道較少。因此，本試驗通過對馬場患子宮內膜炎的母馬進行采樣，分離純化病原菌并檢測其致病性和耐藥性，為馬場診斷及治療此病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 經臨床檢查患子宮內膜炎的母馬,4歲～9歲；SPF小鼠,7周齡～9周齡，體重25 g～30 g。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)肉湯、DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司產品；革蘭氏染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產品；綿羊血平板，南京森貝伽生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 電泳儀，北京六一生物科技有限公司產品；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產品；光學顯微鏡，英菲洛精密科技(蘇州)有限公司產品；恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司產品；生物安全柜，蘇州賽默飛世爾科技有限公司產品；低溫高速離心機，北京艾本德中國有限公司產品；PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 甘肅某馬場，選臨床檢查為子宮內膜炎的母馬，做好保定與清潔工作后，用開宮器配合輸精套管插入母馬子宮，注入50 mL～100 mL生理鹽水然后抽出沖洗液，低溫保存。

1.2.2 細菌分離與鑒定 將沖洗液置于離心管內，600 r/min離心15 min，取沉淀在血平板上劃線培養(yǎng)細菌并分離純化3次，挑出單個菌落做革蘭氏染色，鏡檢視野下為相同細菌則進行擴增，營養(yǎng)肉湯擴增后進行細菌16S rRNA測序。用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA。用細菌16S通用引物進行擴增，PCR體系：20 μL 2×TaqMaster Mix,16 μL ddH2O,上、下游引物各1 μL，2 μL 模板DNA。細菌16S引物序列為F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min;共34個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。預計片段大小為1 500 bp,PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠電泳成像系統(tǒng)中觀察。驗證擴增條帶大小后進行膠回收。膠回收產物送至天啟(蘭州)生物科技有限公司進行測序。測序結果與NCBI、GenBank 數據庫收錄序列進行對比分析。

1.2.3 動物試驗 參照前期梯度注射試驗結果，選取濃度為1×108CFU/mL的病原菌進行動物試驗，將35只小鼠隨機分為7組，每組各5只。取0.5 mL定量后的細菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，先單獨腹腔注射小鼠，驗證每種菌的致病性，再將菌液混合后腹腔注射到小鼠，驗證混合菌液的致病性，對照組用等量肉湯培養(yǎng)液注射，觀察并記錄小鼠的生理狀況。2 d或死亡后剖檢觀察小鼠大體病變并采樣做回歸試驗，同時取病變組織，在40 mg/mL甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋切片，HE染色后在400倍光鏡下檢查。

1.2.4 藥敏試驗 向比濁管中加入150 μL～200 μL 生理鹽水，挑取劃線純化后的單個菌落與生理鹽水混合均勻，與0.5比濁度標準管比較，增減生理鹽水及細菌量，當濁度一樣時即可。將細菌與生理鹽水混合液100 μL 加入MHB平板，涂布均勻后貼上常用藥敏片。置于恒溫恒濕箱中37 ℃ 培養(yǎng)18 h～24 h后觀察結果。

2 結果

2.1 病原菌分離結果

對8匹母馬樣品進行細菌分離后發(fā)現有3匹母馬呈混合感染，占比為37.5%，5匹為單獨感染，占比為62.5%。分離純化后的細菌在綿羊血平板上分別呈現淺白色(A)、白色(B)、紅色(C)、米白色(D)和灰白色透明且溶血(E,F)(圖1)。經革蘭氏染色后觀察，依次為G+桿狀細菌(A)，G+雙鏈狀細菌(B)，G-單個桿狀細菌(C)，G+單個長鏈或短鏈狀細菌(D)，G+葡萄串狀細菌(E)，G+單個或短鏈狀細菌(F)(圖2)。細菌DNA的PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳顯示片段大小為1 500 bp，符合預期大小(圖3)。細菌16S rRNA測序后，經GenBack數據庫收錄序列進行對比分析，結果為芽孢桿菌(A)、肺炎鏈球菌(B)、大腸埃希氏菌(C)、馬鏈球菌獸疫亞種(D)、葡萄球菌(E)和無乳鏈球菌(F)。8匹患馬中3匹單獨感染大腸埃希氏菌；2匹單獨感染馬鏈球菌獸疫亞種；1匹為大腸埃希氏菌與馬鏈球菌獸疫亞種混合感染；1匹為大腸埃希氏菌﹑馬鏈球菌獸疫亞種﹑葡萄球菌與肺炎鏈球菌混合感染；1匹為大腸埃希氏菌﹑葡萄球菌與無乳鏈球菌混合感染。

A.大腸埃希氏菌；B.葡萄球菌；C.肺炎鏈球菌；D.無乳鏈球菌；E、F.馬鏈球菌獸疫亞種

A.芽孢桿菌；B.肺炎鏈球菌；C.大腸埃希氏菌；D.馬鏈球菌獸疫亞種；E.葡萄球菌；F.無乳鏈球菌

M.DNA 標準DL 2 000;1.大腸埃希氏菌；2.馬鏈球菌獸疫亞種；3.肺炎鏈球菌；4.無乳鏈球菌；5.葡萄球菌

2.2 動物試驗結果

病原菌腹腔注射小鼠后，小鼠精神萎靡不振，廢飲廢食，嗜睡，被毛雜亂，眼部分泌物增加，分別于平均時間16 h(大腸埃希氏菌)、10.5 h(馬鏈球菌獸疫亞種)、18 h(肺炎鏈球菌)、20 h(無乳鏈球菌)后死亡，混合菌液于12.5 h后全部死亡。剖檢顯示，接種馬鏈球菌獸疫亞種小鼠肝臟、肺臟、腎臟和脾臟都有不同程度的充血淤血及腫大。組織切片觀察顯示肺臟、脾臟、腎臟以及肝臟都有嚴重出血及淤血，各組織呈不同程度的損傷破碎(圖4)。腹腔注射葡萄球菌組小鼠無死亡現象，但剖檢見小鼠內臟有充血及滲出?；貧w試驗均分離到攻毒菌(圖5)。

A.正常肺;B.病理肺臟;C.正常脾臟;D.病理脾臟;E.正常腎臟;F.病理腎臟;G.正常肝臟;H.病理肝臟

1.病原菌；2.紅細胞；3.組織碎片

2.3 藥敏試驗結果

根據NCCLS標準,藥敏試驗結果表明分離出的大腸埃希氏菌對四環(huán)素耐藥、對氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢噻肟等敏感；葡萄球菌對青霉素、氨芐西林耐藥、對紅霉素、左氧佛沙星、頭孢唑林等敏感；肺炎鏈球菌對青霉素、紅霉素、四環(huán)素、克拉霉素、頭孢唑林、鏈霉素耐藥，對左氧氟沙星敏感；馬鏈球菌獸疫亞種對氨芐西林有一定耐藥，對青霉素、紅霉素、頭孢類以及左氧氟沙星等敏感；無乳鏈球菌對青霉素、紅霉素、萬古霉素、氨芐西林、四環(huán)素耐藥，對氧氟沙星敏感(表1～表5)。

表1 大腸埃希氏菌藥敏試驗結果

表2 葡萄球菌藥敏試驗結果

表3 肺炎鏈球菌藥敏試驗結果

表4 馬鏈球菌獸疫亞種藥敏試驗結果

表5 無乳鏈球菌藥敏試驗結果

3 討論

本次對馬場患子宮內膜炎母馬進行采樣及實驗室檢查后分離出單獨感染的2種病原菌是大腸埃希氏菌和馬鏈球菌獸疫亞種，并且混合感染都有這2種菌的參與。結果與Pisello L等[8]的結果相符合。大腸埃希氏菌和馬鏈球菌獸疫亞種是馬子宮內膜炎中檢出率最高的2種病原菌。在采樣方面，目前國際常用的方法有子宮內試子法(US)、細胞學刷子法(CB)、子宮內膜活檢法(EB)以及子宮灌洗液法等，子宮灌洗液法在諸多采樣方法中有著檢出率高、假陽性和假陰性率低、對母畜傷害小等優(yōu)勢[9]。綜合考慮個體差異以及不同方法對母畜可能造成的損傷等方面，在諸多方法中選取子宮灌洗液法用于實驗室檢查。本次檢查還分離出了芽孢桿菌、葡萄球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、乳酸桿菌等。與Ricardo M等[10]分離出的結果(大腸埃希氏菌、馬鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌、假銅綠單胞菌、肺炎克雷伯氏菌)比較符合，其中分離出有差異的病原菌可能是由于地理位置、養(yǎng)殖環(huán)境與方式或品種及個體差異所導致的。經過比對分析，認為此次分離出的菌中，芽孢桿菌和乳酸桿菌非病原菌，故不予開展后續(xù)藥敏試驗等。對其余分離出的菌株致病性的研究中，發(fā)現馬鏈球菌獸疫亞種致病性最強，其次為大腸埃希氏菌和肺炎鏈球菌等，短時間內即可造成小鼠死亡。剖檢病死小鼠，經大體解剖以及病理切片發(fā)現病原菌感染造成小鼠內臟明顯病變，證明分離出的病原菌的致病性十分強大。對于分離出的病原菌進行的藥敏試驗表明，病原菌已經對某些常用抗菌藥物產生了較強的耐藥性。但是到目前為止，國內乃至全世界治療馬子宮內膜炎的方法依舊為大量全身性的使用抗菌藥物。耐藥性的產生對目前馬子宮內膜炎的防治構成了嚴峻的挑戰(zhàn)，同時由于本病的病原菌種類與分型多種多樣，疫苗的研制遙遙無期，尋找新的方法來預防和治療本病已經刻不容緩。王德超等[11]進行了中草藥方劑對馬子宮內膜炎療效的探究，取得了一定效果。但仍需從發(fā)病原因、病理機制以及毒力因子等方面進行系統(tǒng)性的綜合研究。

對于本病，仍需貫徹預防大于治療的方針，加強飼養(yǎng)管理，尤其是產前和產后的護理工作；用人工授精的方式代替自然交配，人工授精時器械應嚴格消毒，操作得當，注意不要對子宮造成損傷。母馬產駒前要更換到干凈、衛(wèi)生、安靜的房間，持續(xù)關注其生理狀況，一旦發(fā)生難產、胎衣不下等情況要及時采取措施，防止產后感染。