李亮亮,于 躍，王天嬌，丁相丹，胡樂玉，王長法，劉文強(qiáng)，劉桂芹，任慧英，王彤彤 *

(1.聊城大學(xué)毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東聊城 252000；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109)

皰疹病毒屬于皰疹病毒科，感染宿主廣泛，能夠感染多種動物[1]。馬皰疹病毒(Equine herpesvirus，EHV)是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，其特點(diǎn)是具有溶細(xì)胞性感染，并可建立終生潛伏，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時，可以被周期性的激活[2-3]。目前全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)馬屬動物皰疹病毒包含9個亞型(EHV-1～9)，其中，EHV-1～5的自然宿主為馬[4]，而EHV-6～8的自然宿主是驢[5-6]，不同亞型之間的核苷酸序列同源性較低，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，馬皰疹病毒8型(EHV-8)與EHV-1、EHV-4在血清學(xué)上具有交叉免疫反應(yīng)[7]。

EHV-8又名驢皰疹病毒3型(Asinine herpes virus 3，AHV-3)，驢、馬對該病毒均易感，該病毒感染可導(dǎo)致馬屬動物出現(xiàn)呼吸癥狀和流產(chǎn)現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為大量漿液性或膿性鼻液、孕畜流產(chǎn)和產(chǎn)弱駒等癥狀，嚴(yán)重危害馬屬動物的健康[8]。我們團(tuán)隊(duì)前期通過常規(guī)PCR檢測發(fā)現(xiàn)EHV-8在規(guī)模化驢場的流行率較高，是導(dǎo)致當(dāng)前驢群流產(chǎn)和呼吸道疾病的主要病原之一，給驢產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。鑒于當(dāng)前市場上僅有馬皰疹病毒1型(EHV-1)和4型(EHV-4)核酸檢測試劑盒和ELISA試劑盒，且試劑盒自身存在較大缺陷，無法鑒別EHV-1、EHV-4和EHV-8的感染，且現(xiàn)存商品化試劑盒檢測結(jié)果特異性差，同時存在靈敏度低、假陽性、耗時、依賴進(jìn)口，花費(fèi)高昂等缺點(diǎn)。因此亟待開發(fā)精確、靈敏、快速、低成本的臨床檢測EHV-8方法。本研究以EHV-8ORF70基因的高度保守區(qū)域序列作為靶標(biāo)，建立的EHV-8熒光定量PCR檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好的特點(diǎn)。該方法推廣應(yīng)用有助于后續(xù)EHV-8感染的分子流行病學(xué)調(diào)查和致病機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和臨床樣品 EHV-8 SDLC66毒株(GenBank登錄號：MW816102)；EHV-1、EHV-4和EHV-8ORF70全長基因質(zhì)粒由金唯智生物科技有限公司合成；臨床驢血清的樣本均保存于聊城大學(xué)毛驢研究院種質(zhì)資源庫。

1.1.2 主要試劑 病毒DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，美基生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；PremixTaqTMDNA 聚合酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)、pMD18-T，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR反應(yīng)試劑(TaqManTMMultiplex Master Mix)，上海英駿生物有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀(TC-96/G/H)，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；低溫超高速離心機(jī)(5910R)，Eppendorf公司產(chǎn)品；生化恒溫培養(yǎng)箱(SPX-100B-Z)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；垂直層流潔凈工作臺(HCB-1300V)，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀(DYCP-32B)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS)，Biorad公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀，Biorad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank發(fā)表的EHV-1 Army 183(GenBank登錄號：KU206477.1)、EHV-4 NS80567(GenBank登錄號：AF030027.1)、EHV-8 SDLC66毒株序列，利用MagAlign軟件分別對ORF70基因序列進(jìn)行比對和分析，確定EHV-8ORF70的保守區(qū)域，利用Primer Premier 7.0軟件設(shè)計(jì)針對EHV-8ORF70基因的特異性引物和探針用于real-time PCR檢測。上游引物B1序列為：5′-ACTCCAGTGCAGCGGATTCGTCTTCC-3′，下游引物B2序列為：5′-GTCCAATGAGAGCCAAGCAAAT-3′，熒光探針序列為：5′-TCCGAAAACCAATTGTCGCAGGAAAACGTA-3′，探針的羧基端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)FAM，羥基端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)TAMRA。引物及探針由華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 特異性擴(kuò)增試驗(yàn) 利用特異性擴(kuò)增EHV-8ORF70的定量引物分別擴(kuò)增相同濃度的含EHV-1、EHV-4、EHV-8病毒ORF70全長基因的質(zhì)粒DNA，每個樣品做3次重復(fù)，通過擴(kuò)增曲線以及Ct值以檢測引物的特異性。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以提取的EHV-8 SDLC66病毒基因組DNA為模板，利用EHV-8定量檢測引物擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)體系為：2×PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 12 s，共30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定后進(jìn)行膠回收，連接到pMD18-T載體中，經(jīng)華大基因測序獲得陽性的克隆質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 通過Nanodrop儀器測定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度，根據(jù)公式：標(biāo)準(zhǔn)品濃度×6×1014/[(載體大小+目的片段大小)×2×324]計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。然后稀釋EHV-8標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板，分別為1010～102拷貝/μL。配制熒光定量PCR反應(yīng)液：2×qPCR Mix 10 μL，上游引物和下游引物各1 μL(20 μmol/L)，熒光探針1 μL(10 mmol/L)，上述稀釋后的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板各2 μL，無菌雙蒸水5 μL，并設(shè)陰性對照?；靹蚝笤跓晒舛縋CR儀進(jìn)行檢測。

PCR條件為：預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；熔解曲線 60 ℃→95 ℃，每升溫0.3 ℃，采集一次熒光信號。熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進(jìn)行，所用熒光為FAM，其吸收波長494 nm，發(fā)射波長522 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，測得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 以10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)和常規(guī)PCR反應(yīng)，以檢測出的最低拷貝數(shù)作為該反應(yīng)的靈敏度。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 利用已建立的熒光定量PCR檢測方法，相同拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)；以10倍倍比稀釋好的9個梯度標(biāo)準(zhǔn)品(1010～102拷貝/μL)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個稀釋度重復(fù)檢測3次，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)，分別計(jì)算組內(nèi)、組間變異系數(shù)，分析熒光定量PCR的組內(nèi)和組間重復(fù)性。

1.2.7 臨床樣本檢測 收集臨床上具有呼吸道癥狀的驢血清樣本120份，借助病毒DNA提取試劑盒分別提取血清病毒DNA，利用已建立的熒光定量PCR進(jìn)行樣本測定，并統(tǒng)計(jì)EHV-8的陽性率。

2 結(jié)果

2.1 特異性擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果

利用EHV-8ORF70基因特異的定量引物分別對相同濃度的EHV-1、EHV-4、EHV-8ORF70質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線如圖1A所示，EHV-8ORF70的Ct值分別是20.570 333 48、20.619 216 92、20.561 676 03，EHV-1ORF70的Ct值分別是31.510 353 09、31.760 150 91、32.358 318 33，EHV-4ORF70的Ct值分別是32.810 890 2、32.761 211 4、33.801 982 88，EHV-1和EHV-4的Ct值屬于陰性檢測范圍。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果僅擴(kuò)增出EHV-8ORF70基因片段(圖1B)，說明該引物對EHV-8ORF70能夠特異性擴(kuò)增。

A.定量PCR；B.瓊脂糖凝膠電泳鑒定;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～3.EHV-8;4～6.EHV-1;7～9.EHV-4

2.2 ORF70基因的擴(kuò)增結(jié)果

以B1、B2為引物，EHV-8 SDLC66毒株的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果出現(xiàn)一條與預(yù)期大小一致的目的片段(186 bp)(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.陰性對照；2.EHV-8 ORF70基因

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

構(gòu)建EHV-8ORF70基因的重組質(zhì)粒，測序結(jié)果表明，插入的ORF70基因片段與已知ORF70序列(MW816102)完全一致，將其命名為pMD18-T-ORF70。將重組質(zhì)粒pMD18-T-ORF70標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，利用優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的熔解曲線如圖3A所示，在熔解溫度Tm值為82.14 ℃時出現(xiàn)唯一的特異性峰，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。通過讀取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3B所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值，縱坐標(biāo)為對應(yīng)的Ct值，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.343 2x+37.558，斜率為-3.3432，R2=0.999 1，說明標(biāo)準(zhǔn)品濃度在1010～102拷貝/μL時，呈良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率E=97.585，說明擴(kuò)增結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

A.熔解曲線；B.標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.4中方法對已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋后，采用已建立好的熒光定量PCR和常規(guī)PCR對稀釋好的模板進(jìn)行靈敏性對比檢測。結(jié)果顯示，熒光定量PCR可檢到最低限度為102拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品(圖4A)，常規(guī)PCR檢到最低限度為104拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品(圖4B)，說明建立的熒光定量PCR的敏感性是常規(guī)PCR的100倍。

A.熒光定量PCR;B.常規(guī)PCR;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～9.1010～102拷貝/μL

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

熒光定量PCR反應(yīng)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，不同稀釋度的模板組間變異系數(shù)為0.06%～0.47%，組內(nèi)變異系數(shù)為0.15%～0.83%，變異系數(shù)均小于1%(表1)，表明該熒光定量PCR具有良好的重復(fù)性。

表1 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣本檢測

對120份驢血清病毒DNA采用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，EHV-8陽性檢出率為32.5%(39/120)。

3 討論

自1987年澳大利亞科研人員首次從驢鼻腔中分離到EHV-8以來[11]，該病毒相繼在中國、以色列等多個國家和地區(qū)報道[12-13]。近年來，伴隨著國內(nèi)驢產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，規(guī)模化養(yǎng)驢基地不斷增多，驢場的疫病逐漸增加，尤其是呼吸系統(tǒng)疾病和驢流產(chǎn)已成為困擾驢產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大難題[14-15]。我們團(tuán)隊(duì)前期分別從病死驢肺臟組織和胎盤組織分離獲得2株EHV-8，并且借助常規(guī)PCR對規(guī)模化驢場的EHV-8感染情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EHV-8在驢群中感染率較高，是導(dǎo)致當(dāng)前驢流產(chǎn)和呼吸道疾病的主要致病原[9,16]。然而，目前國內(nèi)外僅報道EHV-1和EHV-4的檢測方法[17-18]，尚無針對EHV-8的快速、靈敏的檢測方法。因此，亟需建立可靠的EHV-8實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷方法，減少養(yǎng)驢業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究針對ORF70基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，該區(qū)域GC含量較高，引物自身有一個較高的Tm值，從而有效避免引物二聚體的產(chǎn)生，由此建立的熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示，本方法具有敏感性高，最低可檢測100個拷貝；特異性好，熔解曲線均為單一峰，可用于EHV-8與馬皰疹病毒其他亞型(EHV-1、EHV-4)鑒別診斷，EHV-1、EHV-4病毒均顯示陰性；重復(fù)性好，組間和組內(nèi)的變異系數(shù)較?。辉囉迷摲椒▽H血清進(jìn)行EHV-8檢測發(fā)現(xiàn)陽性率為32.5%。因此，本研究建立的熒光定量PCR具有快速、靈敏、穩(wěn)定等特點(diǎn)，適合用于臨床樣品的EHV-8快速檢測。本方法的建立為今后EHV-8的臨床檢測、鑒定及病毒傳播的控制提供了有效的技術(shù)支持，具有較大的應(yīng)用價值。