楊 鵬，楊 源，岳 筠，陳 靜，王 慧，朱二鵬，張雙翔*，文 明,2，程振濤,2*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025;2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025;3.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550008)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是機(jī)體內(nèi)一類重要的免疫相關(guān)分子，屬于模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)家族，其成員至少有10個，廣泛分布于T、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，可通過特異性識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)引起機(jī)體的一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，最終在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮其免疫防御作用，是溝通特異性免疫與非特異性免疫的橋梁[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)支原體的脂蛋白可通過上調(diào)TLR1、TLR2、TLR4、TLR6激活NF-κB通路，引起過度的免疫反應(yīng)，最終介導(dǎo)病變組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生[3-4]。Xu H等[5]研究證明小鼠缺乏TLR7可抑制促炎因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)小鼠肺部抗炎因子的產(chǎn)生，從而減輕病原對肺部組織損傷。Bernard M A等[6]研究發(fā)現(xiàn)TLR8信號傳導(dǎo)觸發(fā)TNF-α的釋放，最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。越來越多的研究證實(shí)TLRs與炎癥發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系。近年來有研究表明，TLRs轉(zhuǎn)錄水平與動物疫病可能存在相關(guān)關(guān)系。黃麗等[7]研究發(fā)現(xiàn)呼腸孤病毒感染雞后TLRs在不同組織器官的表達(dá)量存在差異。姚玉昌等[8]研究發(fā)現(xiàn)TLR4轉(zhuǎn)錄水平能很好地反映羊?qū)型口蹄疫病毒的免疫能力。江孝俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4在小鼠乳腺炎病例中轉(zhuǎn)錄水平存在差異。綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)感染綿羊和山羊可引起嚴(yán)重的纖維素性肺炎和胸膜炎[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同品種羊?qū)o的易感性表現(xiàn)不一，這種差異是否與TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，尚缺乏研究資料。本研究以貴州省內(nèi)4個主要品種山羊?yàn)檠芯繉ο螅瑧?yīng)用Mo進(jìn)行人工感染，對不同品種羊感染后血液、肺臟中TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平差異進(jìn)行分析，為探討TLRs信號通路參與Mo誘導(dǎo)不同品種山羊炎癥反應(yīng)相關(guān)機(jī)理研究提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RNAprep Prue血液總RNA提取試劑盒、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；RNAiso Plus組織總RNA提取試劑盒、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)、PrimeScriptTMRT Master Mix，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 試驗(yàn)用動物與菌株信息 貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊和波爾山羊，3月齡，體重10 kg～15 kg，購自各品種羊貴州省規(guī)模養(yǎng)殖基地。綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae)GZ-QX株，由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.3 主要儀器 多功能梯度PCR儀(VeritiTM96-Well Thermai Cycyer)，美國ABI公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-8C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1600)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(CFX Connect)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 不同品種山羊人工感染試驗(yàn) Mo陰性的貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊和波爾山羊各5頭，分別設(shè)置感染組和對照組(感染組：3頭/組；對照組：2頭/組)。感染組每只山羊氣管注射4 mL(1×108CCU/mL)Mo菌液進(jìn)行感染，對照組注射同等劑量的培養(yǎng)基。2組山羊在飼養(yǎng)條件保持一致的條件下進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。采集0、48、96 h各試驗(yàn)羊抗凝血液樣本45份、黔北麻羊528 h抗凝血液3份、波爾山羊528 h抗凝血液5份，并采集死亡或處死羊的肺臟樣本20份，分析試驗(yàn)羊感染Mo后TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.2.2 試驗(yàn)羊Mo核酸檢測 參考GenBank中登錄的MoHsp70基因(登錄號：HM047293.1)設(shè)計1對特異性引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列為 Mo-F：5′TCGTGCTAACCAAAGAGACTAC3′，Mo-R：5′CAAGTGCGGCTGCTGTTGGTTC3′，預(yù)期擴(kuò)增大小為225 bp。取感染死亡或人工處死的試驗(yàn)羊肺臟樣本，按試劑盒提取樣本DNA；以提取的樣本DNA為模板、Mo-F/R為引物構(gòu)建25 μL PCR反應(yīng)體系(2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL)，按照反應(yīng)程序(預(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀觀察目的基因擴(kuò)增情況。并用ELISA檢測試驗(yàn)羊Mo感染情況。

1.2.3 不同品種山羊TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

1.2.3.1 引物設(shè)計與合成 參考GenBank中已公布的羊TLR1-10基因序列設(shè)計特異性引物和探針(5′端加入6-FAM發(fā)光基團(tuán)，3′端加入BHQ1淬滅基團(tuán))，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2.3.2 Mo感染羊TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平定量檢測 使用RNA提取試劑盒對試驗(yàn)樣本總RNA進(jìn)行提取，并將提取的RNA樣本(1 μg)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以研究小組成員已建立用于檢測羊TLRs基因的TaqMan RT-qPCR方法[11]，試驗(yàn)羊cDNA為模板構(gòu)建20 μL qPCR反應(yīng)體系(體系為Mix 10 μL，F(xiàn)/R各0.5 μL，Probe 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.6 μL)，按照反應(yīng)條件(95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，退火20 s，共40個循環(huán))進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)錄水平檢測。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參基因，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對目的基因mRNA的相對表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)表示為3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；應(yīng)用SPSS20.0軟件分析同一品種山羊肺臟和血液樣本中TLRs基因mRNA表達(dá)量的組間差異，以及不同品種山羊感染后肺臟和血液樣本中相同TLRs基因mRNA表達(dá)量的差異。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 感染羊臨床死亡統(tǒng)計結(jié)果

貴州白山羊在感染Mo后96 h時已全部死亡，貴州黑山羊在感染Mo后144 h時已全部死亡，黔北麻羊在感染Mo后144 h時死亡2只，在感染后528 h統(tǒng)一處死剩余試驗(yàn)羊(1只感染組黔北麻羊、2只對照組黔北麻羊，3只感染組波爾山羊、2只對照組波爾山羊)。

2.2 試驗(yàn)羊Mo核酸檢測結(jié)果

以試驗(yàn)羊肺臟組織樣本DNA為模板，應(yīng)用PCR檢測試驗(yàn)羊肺臟Mo擴(kuò)增情況。結(jié)果顯示，各品種山羊感染組肺臟樣本中均檢測出1條與預(yù)期225 bp大小相符的特異性條帶，而各品種對照組山羊肺臟組織中未出現(xiàn)條帶(圖1)，提示Mo成功感染試驗(yàn)羊。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對照；2～4.貴州黑山羊感染組；5～6.貴州黑山羊?qū)φ战M；7～9.貴州白山羊感染組；10～11.貴州白山羊?qū)φ战M；12～14.黔北麻羊感染組；15～16.黔北麻羊?qū)φ战M；17～19：波爾山羊感染組；20～21.波爾山羊?qū)φ战M；22.陽性對照

2.3 同種山羊不同TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平差異性分析結(jié)果

應(yīng)用TaqMan RT-qPCR檢測試驗(yàn)羊肺臟和血液中TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，貴州黑山羊肺臟中TLR1/4/5/6/8/9/10基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P<0.01)，TLR2基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組(P<0.05)，TLR3/7基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但差異不顯著(P>0.05)(圖2A)；血液中TLR2/4/6/7/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P<0.01)，其余TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但差異不顯著(P>0.05)(圖2B)。貴州白山羊肺臟中TLR1/4/5/6/8/9基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P<0.01)，TLR2/10基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組(P<0.05)，TLR3/7/10轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但差異不顯著(P>0.05)(圖2C)；血液中TLR2/4/6/7/8基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P<0.01)，其余TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但差異不顯著(P>0.05)(圖2D)。黔北麻羊肺臟中TLR4/5/7/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組(P<0.05)，其余TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但差異不顯著(P>0.05)(圖2E)；血液中TLR4/6/7/8/9基因轉(zhuǎn)錄水平與對照組間差異極顯著(P<0.01)，其余TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但差異不顯著(P>0.05)(圖2F)。波爾山羊肺臟中TLR4/5/7/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P<0.01)，其余TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但差異不顯著(P>0.05)(圖2G)；血液中TLR4/6/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P<0.01)，其余TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但差異不顯著(P>0.05)(圖2H)。通過分析發(fā)現(xiàn)，同一品種山羊在感染Mo后肺臟樣本和血液樣本中TLRsmRNA表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的上升，提示TLRs參與山羊的Mo感染過程。

A.貴州黑山羊144 h肺臟；B.貴州黑山羊144 h血液；C.貴州白山羊96 h肺臟；D.貴州白山羊96 h血液；E.黔北麻羊528 h肺臟；F.黔北麻羊528 h血液；G.波爾山羊528 h肺臟；H.波爾山羊528 h血液

2.4 不同種山羊肺臟樣本中TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平差異性分析結(jié)果

應(yīng)用TaqMan RT-qPCR對試驗(yàn)羊肺臟樣本進(jìn)行TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平檢測后，計算每個山羊品種不同TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)，并對種間表達(dá)差異進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果顯示(圖3)，感染后貴州白山羊肺臟TLR1基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)倍數(shù)顯著高于貴州黑山羊、黔北麻羊和波爾山羊(P<0.05)，其余各組間并無顯著性差異(P>0.05)；感染后黔北麻羊波爾山羊肺臟TLR2基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊和貴州白山羊(P<0.01)；感染后肺臟TLR3基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)在各品種山羊間差異不顯著(P>0.05)；波爾山羊肺臟TLR4基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)極顯著高于其余品種山羊(P<0.01)，其余3種羊間以黔北麻羊差異倍數(shù)最高；感染后肺臟TLR5基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)存在顯著差異(P<0.05)，呈現(xiàn)出波爾山羊>黔北麻羊>貴州黑山羊>貴州白山羊；感染后肺臟TLR6基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)貴州黑山羊和貴州白山羊極顯著高于黔北麻羊和波爾山羊(P<0.01)；感染后波爾山羊肺臟TLR7/9基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊、黔北麻羊和波爾山羊(P<0.01)，其余各組間并無顯著差異(P>0.05)；感染后各品種山羊肺臟TLR8/10基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)貴州白山羊>貴州黑山羊>黔北麻羊波爾山羊，且貴州白山羊顯著高于其余品種山羊(P<0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)羊感染Mo后不同品種山羊間肺臟樣本中TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)存在差異，肺臟樣本中TLR1/6/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)與試驗(yàn)羊臨床死亡呈正相關(guān)，而肺臟樣本中TLR2/4/5/7/9基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)與試驗(yàn)羊臨床死亡現(xiàn)象呈負(fù)相關(guān)，提示TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平倍數(shù)差異可能與不同羊?qū)o的易感不同有關(guān)。

差異倍數(shù)=感染組相對表達(dá)量/對照組相對表達(dá)量;小寫字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；小寫字母不相同表示差異顯著(P<0.05)；大寫字母不相同表示差異極顯著(P<0.01)

2.5 不同種山羊血液樣本中TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平差異性分析結(jié)果

應(yīng)用TaqMan RT-qPCR對試驗(yàn)羊感染Mo后0、48、96 h血液樣本進(jìn)行TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平定量檢測后，計算每個山羊品種不同TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)，并對種間表達(dá)差異進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果顯示，感染后各品種山羊間0 h血液中TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)差異不顯著(P>0.05)；感染后4個品種山羊間血液中TLR1/9基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)在48 h和96 h差異不顯著(P>0.05)(圖4A、圖4I)；感染后96 h波爾山羊血液TLR2基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊、貴州白山羊和黔北麻羊(P<0.01)，而在48 h各品種山羊間差異不顯著(P>0.05)(圖4B)；感染后48 h和96 h黔北麻羊血液TLR3基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于貴州黑山羊、貴州白山羊和波爾山羊(P<0.05)(圖4C)；感染后48 h貴州白山羊和波爾山羊血液TLR4基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于貴州黑山羊和黔北麻羊(P<0.05)，感染后96 h貴州黑山羊和貴州白山羊血液TLR4基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于黔北麻羊和波爾山羊(P<0.05)(圖4D)；感染后48 h和96 h波爾山羊血液TLR5基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊、貴州白山羊和黔北麻羊(P<0.01)(圖4E)；感染后48 h貴州白山羊和波爾山羊血液TLR6基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊和黔北麻羊(P<0.01)，感染后96 h貴州白山羊血液TLR6基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊、黔北麻羊和波爾山羊(P<0.01)(圖4F)；感染后48 h貴州白山羊血液TLR7基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊、黔北麻羊和波爾山羊(P<0.01)，感染后96 h貴州黑山羊和貴州白山羊血液TLR7基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于黔北麻羊和波爾山羊(P<0.05)(圖4G)；感染后48 h和96 h貴州白山羊血液TLR8基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊、黔北麻羊和波爾山羊(P<0.01)(圖4H)；感染后48 h和96 h貴州黑山羊和貴州白山羊血液TLR10基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)高于黔北麻羊和波爾山羊(P<0.05)(圖4J)。分析發(fā)現(xiàn)，不同品種山羊之間血液樣本中TLRs基因的表達(dá)量存在差異，血液中TLR2/4/5/6/7/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)在感染死亡山羊與感染未死亡山羊間呈現(xiàn)出明顯的差異，且TLR4/6/7/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)與試驗(yàn)羊臨床死亡呈正相關(guān)，TLR2/5呈負(fù)相關(guān)；因此提示TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平可能與不同品種羊?qū)o的易感差異有關(guān)。

A.TLR1；B.TLR2；C.TLR3；D.TLR4；E.TLR5；F.TLR6；G.TLR7；H，TLR8；I.TLR9；J.TLR10;小寫字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；小寫字母不相同表示差異顯著(P<0.05)；大寫字母不相同表示差異極顯著(P<0.01)

3 討論

Toll樣受體(TLRs)作為天然免疫的模式識別受體，激活后可識別PAMPs和DAMPs，刺激機(jī)體先天性免疫應(yīng)答并提高獲得性免疫應(yīng)答，從而保護(hù)機(jī)體不受病原微生物侵害，但TLRs的信號傳導(dǎo)也會導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)性炎癥反應(yīng)而損傷機(jī)體[12-15]。甘源等[16]用豬肺炎支原體(Mhp)感染不同品種豬時發(fā)現(xiàn)各品種間同一部位的病變存在差異，本研究發(fā)現(xiàn)不同品種山羊感染后也出現(xiàn)不同癥狀，其中貴州白山羊試驗(yàn)組最先出現(xiàn)流膿性鼻涕、流淚和呼吸困難等癥狀，其次為貴州黑山羊和黔北麻羊，最后波爾山羊也出現(xiàn)相應(yīng)癥狀[17]；還有研究發(fā)現(xiàn)抗病性不同的小鼠感染后TLRs會出現(xiàn)差異表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因表達(dá)可加重大鼠肺部感染的發(fā)生發(fā)展，并進(jìn)一步促進(jìn)肺部病變，還發(fā)現(xiàn)抑制肺組織TLR2和TLR4 mRNA的表達(dá)進(jìn)而減輕重癥急性胰腺炎肺損傷程度[18]，還有研究發(fā)現(xiàn)抗病性強(qiáng)的小鼠體內(nèi)TLR9轉(zhuǎn)錄水平越高[19]。以上研究結(jié)果提示，不同動物或者同一動物不同品系在感染病原后呈現(xiàn)的臨床癥狀可能存在一定差異。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同品種山羊在感染Mo后，導(dǎo)致局部及全身TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，引起了山羊局部肺臟的炎癥及全身性的炎癥表現(xiàn)，貴州白山羊首先臨床癥狀最為明顯，其次是貴州黑山羊和黔北麻羊，而波爾山羊只出現(xiàn)輕微臨床癥狀，提示不同品種山羊?qū)o的易感性存在一定差異，但該差異是否與不同品種山羊TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，尚缺乏相關(guān)資料；本研究通過Mo人工感染，分析感染后不同品種山羊TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平差異，以期補(bǔ)充TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平與Mo感染差異的相關(guān)研究資料。

現(xiàn)有研究表明TLR2/4基因在不同品種豬間存在基因多態(tài)性差異，這種差異引起了基因結(jié)構(gòu)域改變，使TLR2/4基因功能發(fā)生變化，間接影響了機(jī)體健康[20-21]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，不同品種山羊之間TLR2基因也存在多態(tài)性差異，這種差異影響不同品種山羊TLR2基因結(jié)構(gòu)域[22]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平與機(jī)體的抗病性密切相關(guān)，王建立等[23]研究發(fā)現(xiàn)TLRs基因的轉(zhuǎn)錄水平與豬抵抗病毒性感染存在相關(guān)性，TLR2和TLR4基因表達(dá)調(diào)控仔豬的免疫應(yīng)答功能。研究發(fā)現(xiàn)TLR2/4基因表達(dá)減少能改善大鼠肺部功能、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子的表達(dá)，對肺組織病理損傷有明顯改善[24]。趙一萍等[25]發(fā)現(xiàn)蒙古馬不同組織器官TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA水基因平存在差異，影響不同組織器官對病原產(chǎn)生不同反應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)羊在感染Mo后其肺臟和血液中TLR1/2/4/5/6/7/8/10基因表達(dá)量顯著高于對照組，這可能因?yàn)镸o感染激活TLRs信號通路，導(dǎo)致TLR1/2/4/5/6/7/8/10基因顯著表達(dá)識別PAMPs和DAMPs，激活機(jī)體免疫應(yīng)答而保護(hù)機(jī)體，越來越多的研究證明TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平可能與疫病易感性存在相關(guān)關(guān)系。

動物疫病的發(fā)生可能與TLRs存在密切的聯(lián)系，唐夢君等[26]研究發(fā)現(xiàn)TLR1基因表達(dá)可刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體不受細(xì)菌侵害，與本文發(fā)現(xiàn)不同品種山羊感染Mo后TLR1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)的結(jié)果相似，TLR1基因轉(zhuǎn)錄水平上升激活下級信號通路，從而發(fā)揮抗感染的作用，本研究還發(fā)現(xiàn)早期死亡貴州白山羊肺臟中TLR1/6/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于其余品種山羊，與試驗(yàn)羊臨床死亡現(xiàn)象呈正相關(guān)，這可能因?yàn)镸o感染導(dǎo)致TLR1/6/8/10基因顯著表達(dá)，刺激機(jī)體分泌大量炎性因子加速肺臟炎癥發(fā)展，所以山羊快速死亡，而在波爾山羊體內(nèi)TLR1/6/8/10基因表達(dá)差異倍數(shù)顯著低于貴州白山羊，導(dǎo)致波爾山羊分泌炎性因子較貴州白山羊少，故而表現(xiàn)出不同的臨床差異；而TLR2/4/5/7/9基因表達(dá)差異倍數(shù)與試驗(yàn)羊臨床死亡現(xiàn)象呈負(fù)相關(guān)，這可能是由于感染死亡山羊TLR2/4/5/7/9基因表達(dá)上調(diào)量較未死亡山羊少，導(dǎo)致激活機(jī)體免疫應(yīng)答程度出現(xiàn)差異，繼而在不同品種山羊間表現(xiàn)出易感性的差異。研究發(fā)現(xiàn)TLR6基因可與TLR2基因協(xié)同作用以激活機(jī)體免疫[27-28]，TLR2/9基因表達(dá)與小鼠結(jié)腸炎存在緊密的聯(lián)系，這可能與TLR2/4基因可通過識別革蘭氏陰性菌LPS從而激活機(jī)體免疫有關(guān)，本文也發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)羊感染Mo后TLR2/4基因在不同品種間出現(xiàn)差異表達(dá)，TLR2/4基因表達(dá)差異可能導(dǎo)致不同品種羊的免疫存在強(qiáng)弱差異，從而在不同品種山羊間表現(xiàn)出不同癥狀。本研究還發(fā)現(xiàn)隨感染時間的變化血液樣本中TLR4/6/7/8/10基因表達(dá)差異倍數(shù)顯著高于黔北麻羊和波爾山羊，與試驗(yàn)羊臨床死亡現(xiàn)象呈正相關(guān)，而TLR2/5基因表達(dá)差異倍數(shù)試驗(yàn)羊臨床死亡現(xiàn)象呈負(fù)相關(guān)，TLRs基因表達(dá)差異倍數(shù)在肺臟和血液中出現(xiàn)差異，具體機(jī)制尚未可知。綜合臨床試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期死亡的貴州黑山羊、貴州白山羊和黔北麻羊與感染未死亡的波爾山羊間在肺臟和血液中存在TLR1/2/4/5/6/7/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，提示TLR1/2/4/5/6/7/8/10基因轉(zhuǎn)錄水平可能與不同品種山羊?qū)o存在易感差異有密切的關(guān)系，TLR4/6/7/8/10基因表達(dá)與山羊感染Mo呈正相關(guān)，而TLR2/5基因表達(dá)與山羊感染Mo呈負(fù)相關(guān)。