李 毅， 李 爽， 張曉玲， 曾 新， 桑 鵬， 楊力權

(1.大理大學 數學與計算機學院， 大理 671003； 2.大理大學 農學與生物科學學院， 大理 671003)

1 引 言

獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)，俗稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的烈性傳染病. 據世界衛(wèi)生組織統計，艾滋病在全球廣泛傳播，嚴重威脅人類健康. 盡管，終生的抗病毒治療可將艾滋病緩解為慢性病的范疇、顯著延長艾滋病患者的生存時間，但諸如癌癥等長期用藥的副作用仍然給患者造成巨大的負擔.

作為唯一暴露在病毒顆粒表面的病毒編碼蛋白，包膜蛋白gp120負責識別和結合宿主細胞表面受體以觸發(fā)一系列的感染事件[1]. 為使其保守的功能位點免受宿主中和抗體的攻擊，gp120利用其序列變異和結構柔性逃避宿主免疫識別[2]，進而促使病毒表現出不同的中和表型[3]. 根據多種抗體滴定的實驗數據，可將HIV劃分為中和抵抗與中和敏感兩種極端中和表型[4]. 其中，中和抵抗表型毒株主要分離自HIV長期攜帶者的血漿，而中和敏感表型毒株則主要來自實驗室的傳代培養(yǎng)[5].

2015年，研究人員使用氫氘交換耦合質譜的技術觀測了多種中和抗體與gp120的相互作用[6]. 實驗結果指出，清除病毒效力較高的中和抗體僅在gp120的功能位點引起局部作用，而效力較低的中和抗體則與整個gp120的精細變化有關. 以此進一步推論，由gp120序列變異引起的構象柔性可能是造成HIV不同中和表型的主要分子機制.

因此，我們從gp120結構動態(tài)性的角度探索了極端中和表型HIV的分子機制[7]. 從實驗標定中和表型的HIV譜系中，隨機選擇了兩株具有極端中和表型的HIV分離株，通過gp120結構模型的構建、分子動力學模擬和自由能圖譜分析，初步揭示了HIV中和表型的分子機制. 中和抵抗比中和敏感gp120具有更低的結構穩(wěn)定性和更高的構象柔性. 病毒包膜蛋白中負責非共價相互作用的結構區(qū)域(如layer 1和L1環(huán))在中和敏感gp120中表現出顯著更高的構象柔性. 因此，gp120的構象穩(wěn)定性可能會更易遭到破壞而發(fā)生轉換. 此外，中和敏感比中和抵抗gp120具有更多涉及協同運動的結構單元. 特別是，在諸如layers 1-2和V1/V2區(qū)域的結構單元，運動方向上的差異會使中和敏感gp120更易發(fā)生構象轉換. 最后，中和敏感比中和抵抗gp120具有更大、更粗糙和更復雜的自由能表面，且中和敏感gp120自由能圖譜中的絕大多數自由能最小化區(qū)域具有比中和抵抗gp120圖譜中更高的自由能水平，表明前者比后者具有更大的構象熵、更豐富的構象狀態(tài)和更復雜的能力學行為.

盡管HIV中和表型的潛在分子機制已被初步探索，但極端中和表型HIV的熱力學分子基礎仍待進一步闡明. 一般認為，中和敏感比中和抵抗gp120具有更高的構象柔性以便發(fā)生構象轉換. 但是，極端中和表型HIV包膜蛋白gp120是否具有不同的熱力學性質，其折疊或解折疊是否與中和表型相關等問題仍不清楚. 為此，本文在先前關于極端中和表型HIV毒株包膜蛋白gp120構象柔性差異的研究基礎上，在逐漸升高的溫度下進行了高溫分子動力學模擬，以研究二者在結構穩(wěn)定性、解折疊和構象柔性上的差異. 研究結果不僅進一步證實了極端中和表型HIV毒株包膜蛋白gp120具有顯著不同的構象柔性，還明確了HIV極端中和表型與包膜蛋白gp120熱力學性質的關聯.

2 材料和方法

2.1結構模型構建

極端中和表型HIV分離株從實驗標定的中和表型譜系中隨機選取，其氨基酸序列取自蛋白質序列數據庫UniProt(http://www.uniprot.org). 中和抵抗毒株H061.14與中和敏感毒株R2的索引號分別為A4ZPW8和Q9WPZ4. 構建gp120結構模型所用模板選自蛋白質結構數據庫PDB(http://www.rcsb.org)中冷凍電鏡解析的代表性HIV包膜蛋白結構(索引號為5FYJ，分辨率為3.4 ?)[8]. 利用軟件包MODELLER V9.15進行同源模建(homology modeling)[9]. 所選模板與靶序列具有高度的序列一致性. 以分子概率密度函數值最小為標準，從構造的20個候選模型中選取具有最佳立體化學質量的結構作為最終模型.

2.2 分子動力學模擬

以上述構建的中和抵抗與中和敏感gp120結構模型為初始，使用GROMACS V 5.1.4軟件包[10]和AMBER99SB-ILDN力場[11]進行分子動力學模擬. 將初始結構放置于具有周期邊界條件的十二面體盒子中，保證蛋白質中任意原子與盒子邊界的距離不小于10 ?. 然后，加入由TIP3P模型[12]描述的水分子，添加Na+、Cl-離子以使蛋白質-水系統在呈電中性的同時還具有150 mM的鹽濃度. 為了消除原子間立體化學沖突，并使蛋白質充分浸潤于水溶劑中，依次進行了最陡下降法能量最小化和固定蛋白質重原子運動的位置限制性模擬. 最后，為保證模擬系統的穩(wěn)定性，進行了由1 ns的等容等溫(NVT)系綜和1.5 ns的等壓等溫(NPT)系綜組成的預模擬.

對于中和抵抗與中和敏感gp120，分別在300 K、373 K和473 K進行了三次30 ns的多復本分子動力學模擬. 每個復本的初始原子速度由相應溫度下的麥克斯韋分布隨機分配. 具體模擬參數如下：采用LINCS算法[13]約束共價鍵長，積分時間步長為2 fs；結構快照的輸出頻率為10 ps；恒壓器耦合壓強為1 atm，耦合時間常數τp為2 ps；溶質(蛋白質)和溶劑(水分子與抗衡離子)的溫度被分別耦合于對應溫度下，耦合時間常數τt均為0.1 ps；使用PME算法[14]處理長程靜電相互作用，內插階為4、傅立葉網格為0.16 nm；庫倫力的截斷半徑為1 nm；使用雙程截斷方案處理范德華相互作用，其中短程和長程的截斷半徑分別為1nm和1.4 nm；非鍵相互作用的更新頻率設為10個積分步長.

2.3 軌跡分析

軌跡的讀取、骨架原子均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)的計算，以及解折疊含量Q的測算均使用MDTraj軟件包[15]. 使用GROMACS內置的gmx rmsf工具計算殘基Cα原子的均方根波動(root mean square fluctuation, RMSF).

3 結 果

3.1 序列和結構比較

圖1 極端中和表型HIV包膜蛋白gp120的序列和結構.

3.2 全局結構波動

通過計算軌跡中gp120骨架原子相對于初始結構的RMSD值，可評估模擬過程中gp120的全局結構波動[18]. 從圖2可以看出，在所有溫度下，盡管中和抵抗與中和敏感gp120在模擬初期具有相似的RMSD值. 但隨著模擬的進行，中和敏感比中和抵抗gp120表現出顯著更高的RMSD值，說明中和敏感比中和抵抗gp120發(fā)生了相對于初始結構更大的構象偏差.

圖2 不同溫度下，中和抵抗(藍線)與中和敏感(綠線)gp120三個復本(R1-3)相對于初始結構骨架原子均方根偏差隨時間變化的曲線.

在常溫下，中和抵抗與中和敏感gp120的RMSD值在0-15ns模擬期間幾乎一致. 此后，中和敏感gp120的兩個復本表現出比中和抵抗gp120更高的RMSD值，直至模擬結束. 隨著模擬溫度的升高，中和抵抗與中和敏感gp120的RMSD值均逐漸增大. 盡管如此，中和敏感gp120的RMSD曲線抬升速度要大于中和抵抗gp120，最終導致了前者更大的結構偏差.

以上結果表明，在同一溫度下，中和敏感比中和抵抗gp120表現出更大的結構偏差或更高的全局結構波動，說明中和抵抗比中和敏感gp120具有更穩(wěn)定的結構.

3.3 解折疊程度

為了比較中和抵抗與中和敏感gp120的解折疊程度，不同溫度下gp120相對于初始結構的天然接觸含量Q[19]隨時間的變化顯示在圖3中. 在常溫下，中和抵抗與中和敏感gp120均含有90%左右的天然接觸含量. 中和抵抗gp120三個復本的天然接觸含量分布較為集中，而中和敏感gp120各個復本則分布在92%至88%之間的區(qū)域中，總體上較中和抵抗gp120具有更多的天然接觸含量.

圖3 不同溫度下，中和抵抗(藍線)與中和敏感(綠線)gp120三個復本(R1-3)天然接觸含量Q隨時間變化的曲線.

圖4 中和抵抗(藍色)與中和敏感(綠色)gp120在RMSD和Q空間中的群體分布.

圖5 不同溫度下，中和抵抗(藍線)與中和敏感(綠線)gp120的Cα原子均方根波動曲線.

隨著溫度的升高，中和敏感和中和抵抗gp120的天然接觸含量均逐漸降低，并在473 K下低至70%左右. 在373 K溫度下，中和抵抗與中和敏感gp120具有非常相似的天然接觸含量曲線，說明中和抵抗與中和敏感gp120在該溫度下具有相似的解折疊程度. 在473 K模擬溫度下，中和抵抗gp120能較快到達較低的天然接觸水平，說明中和抵抗gp120的解折疊程度較高.

比較中和抵抗與中和敏感gp120之間天然接觸含量的差異可以看出，中和抵抗gp120的天然接觸含量總比中和敏感gp120的稍低. 但兩者差異較小，說明相對于初始結構的天然接觸含量在中和抵抗與中和敏感gp120之間不具備顯著差異，也就是中和抵抗與中和敏感gp120具有相似的解折疊程度.

3.4 構象群體分布

為了比較中和抵抗與中和敏感gp120在構象群體分布上的差異，各個溫度下的軌跡被投射到由RMSD和Q組成的空間中. 如圖4所示，中和抵抗與中和敏感gp120具有相似的構象群體分布范圍，均位于RMSD從0.2至1 nm和Q從95%至70%之間的區(qū)域. 但是，中和抵抗與中和敏感gp120具有不同的構象群體分布形態(tài). 對于中和抵抗gp120，其構象群體可被劃分為兩個主要區(qū)域，即RMSD約0.3 nm、Q約85%的區(qū)域和RMSD約0.8 nm、Q約75%的區(qū)域. 而中和敏感gp120則至少具有四個主要的構象群體，即RMSD約0.2 nm、Q約88%的區(qū)域；RMSD約0.4 nm、Q約83%的區(qū)域；RMSD約0.8 nm、Q約83%的區(qū)域和RMSD約0.8 nm、Q約75%的區(qū)域.

上述結果說明，中和敏感比中和抵抗gp120在模擬過程中經歷了更大的構象變化，因而具有更高的構象熵. 中和敏感比中和抵抗gp120具有更多樣的構象群體分布，即具有更豐富的構象多樣性.

3.5 局部構象柔性

通過計算中和抵抗與中和敏感gp120每個殘基Cα原子的均方根波動RMSF值，可定量描述蛋白質局部結構區(qū)域的波動[20]. 此外，中和抵抗與中和敏感gp120的RMSF平均值，以及等同殘基位置上中和抵抗gp120的RMSF值減去中和敏感gp120的RMSF值所得到的差值，能進一步反應各個溫度下中和抵抗與中和敏感gp120的局部構象柔性.

在常溫下，中和抵抗與中和敏感gp120的RMSF平均值分別為0.12和0.15 nm，表明中和敏感gp120具有更高的構象柔性. 除少數區(qū)域外，中和抵抗與中和敏感gp120的絕大部分結構區(qū)域均具有相似RMSF曲線，說明兩者具有相似的構象柔性分布特征. 兩者構象柔性差異明顯的區(qū)域主要集中在V1/V2區(qū)域和V4-5環(huán).

隨著溫度的升高，中和抵抗與中和敏感gp120的RMSF值均隨之增大，說明全局構象柔性也相應增大. 但是，中和敏感總比中和抵抗gp120具有更大的RMSF平均值，中和抵抗與中和敏感gp120在373 K下的RMSF均值分別為0.13和0.15 nm，在473 K下的RMSF均值分別為0.21和0.23 nm. 對于在常溫下就比中和抵抗gp120較高的區(qū)域，V1/V2區(qū)域在373 K下仍然維持中和敏感高于中和抵抗gp120的趨勢，但在473 K翻轉；V4-5環(huán)則在兩個高溫下均呈現出中和敏感gp120較高的RMSF值.

4 討 論

作為唯一暴露在外的病毒編碼蛋白，包膜蛋白gp120在HIV病毒侵染和免疫逃逸中扮演著關鍵角色[21]. 實驗[5]和理論[7]研究都指出其與抗體的相互作用在很大程度上決定了HIV的中和表型. 在我們前期的研究中，極端中和表型HIV的包膜蛋白gp120的結構模型呈現出高度的相似性[7]. 經過分子動力學模擬后，極端中和表型在結構動態(tài)性、構象柔性、大尺度分子運動和自由能水平上均表現出差異[22]. 該研究從包膜蛋白gp120動態(tài)性的角度初步揭示了HIV中和表型的分子機制.

在本文中，我們進一步研究了包膜蛋白gp120熱力學性質與HIV中和表型的關系. 在高溫分子動力學模擬中，包膜蛋白gp120表現出與HIV極端中和表型呈正相關的熱力學性質，即中和敏感gp120在各溫度下均相較中和抵抗gp120具有更大的全局結構波動、更多樣的構象群體分布和更高的局部構象柔性. 但是，從天然接觸含量可以看出，中和抵抗和中和敏感gp120在各溫度下均具有相似的解折疊程度，說明HIV中和表型與其包膜蛋白gp120的解折疊程度無關.

與球狀蛋白的解折疊[23]不同，gp120由于除核心結構外，還具有伸展在外的可變環(huán)區(qū). 其構象柔性和解折疊程度并不像球狀蛋白那樣呈現出嚴格的正相關關系. 而且，gp120高度變異的序列很可能不存在諸如鹽橋[24]等強相互作用，以維持其熱力學性質. 蛋白質的解折疊可以被記作其折疊成天然構象的逆過程，本研究從高溫解折疊熱力學的角度明確了極端中和表型HIV背后的分子基礎.

5 結 論

在本研究中，延續(xù)我們前期關于極端中和表型HIV包膜蛋白gp120的分子動力學模擬，以中和抵抗H061.14與中和敏感R2兩個極端中和表型HIV的gp120結構模型為研究對象，通過比較中和抵抗和中和敏感gp120在全局結構波動、天然接觸含量、構象群體分布、局部構象柔性等方面的差異，以期闡釋HIV中和表型與其包膜蛋白gp120熱力學性質之間的關系. 主要結果為:(1)HIV中和表型與gp120的熱力學性質呈正相關；(2)中和敏感比中和抵抗gp120表現出更大的結構波動、更多的構象狀態(tài)和更高的全局構象柔性；(3)二者具有相似的天然接觸含量溫度，說明HIV中和表型與gp120解折疊程度無關. 總之，本文的研究結果從熱力學的角度闡釋了HIV包膜蛋白gp120的“結構-熱力學性質-表型”三者間的關系，明確了HIV中和表型背后的分子基礎.