楊和銀 魏海燕 田云濤 阿依帕夏·艾沙 姜伶 吐爾遜娜依·艾海提

(喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆 喀什 844000)

心血管疾病是嚴重威脅人類生命健康的疾病之一，隨著患病人群的不斷增多，碘造影劑的使用率也逐年增加，同時，由于使用碘造影劑造成的碘造影劑急性腎衰竭患者量也有一定增加〔1〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，患者碘造影劑腎病主要由急性腎損傷發(fā)展而來，在患者接受碘造影劑初期及時發(fā)現(xiàn)急性腎損傷并采取有效的干預(yù)措施，可有效降低患者進展為慢性腎衰竭的概率，大大提高患者的生活質(zhì)量和預(yù)后〔2〕。急性腎衰竭患者腎小管上皮細胞呈不同程度的急性變性、壞死狀態(tài)，腎小管擴張，間質(zhì)水腫〔3〕。前期研究〔3〕結(jié)果顯示，造影劑所致急性腎損傷組的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達升高，長鏈非編碼RNA(LncRNA)非編碼基因(XLOC_036125)和與之空間位置相鄰的Lgmn亦表達升高，且 Lgmn與Beclin-1 功能相似，但尚不明確 LncRNA 是否通過Lgmn 調(diào)控自噬而影響對比劑所致急性腎損傷(CI-AKI)發(fā)生，本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上從細胞和基因水平，探究CI-AKI中XLOC_036125與Lgmn、Beclin-1的作用關(guān)系。

1 資料與方法

1.1主要試劑 實驗用大鼠腎小管上皮細胞HK-2 購于美國模式菌種收集中心(ATCC)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；CCK8試劑盒購于日本同仁公司；RIPA裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡試劑盒購于美國Invitrogen公司；兔抗鼠β-actin抗體、鼠抗人Lgmn抗體、鼠抗人 Beclin-1抗體均購于美國Abcam公司；碘化丙啶(PI)購于中國上海翊圣生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠腎小管細胞 CI-AKI 模型構(gòu)建 腎小管上皮細胞HK-2 培養(yǎng)于含10%磷酸鹽緩沖液(PBS)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長至80%～90%融合時，用0.25%胰酶消化并接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細胞均勻接種，隔天換液，當細胞處于亞融合狀態(tài)時換無血清培養(yǎng)基孵育 24 h，添加10 μmol/L順鉑常規(guī)孵育 24 h，構(gòu)建大鼠腎小管細胞 CI-AKI 模型。

1.2.2重組表達質(zhì)粒構(gòu)建及質(zhì)粒提取 LncRNA XLOC_036125及Lgmn穩(wěn)定過表達重組表達質(zhì)粒、空載體對照質(zhì)粒及菌種均委托美國 GeneCopoeia 公司進行構(gòu)建，LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA及LncRNA XLOC_036125-siRNA-control、Lgmn-siRNA-control購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司，置于-80℃保存。

質(zhì)粒提取參照OMEGA公司產(chǎn)品無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒操作說明進行，收集菌落培養(yǎng)后形成的菌液，離心，棄上清，依次加入溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行重懸，離心，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管，加入等體積內(nèi)毒素吸附(ETR Binding)緩沖液，轉(zhuǎn)移至純化柱，離心，棄廢液，加入內(nèi)毒素洗滌(ETR Wash)緩沖液，重新離心后加入純化柱；加入3-羥基丁酸乙酯(EHB)緩沖液，離心后加入純化柱；加入DNA Wash緩沖液，離心清洗；轉(zhuǎn)移至新EP管，加入無內(nèi)毒素緩沖液，離心，收集DNA溶液，置于-20℃保存。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 細胞轉(zhuǎn)染采用lipofectamine 2000試劑盒，LncRNA XLOC_036125及Lgmn穩(wěn)定過表達重組表達質(zhì)粒、空載體對照質(zhì)粒及LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA、LncRNA XLOC_036125-siRNA-control、Lgmn-siRNA-control分別轉(zhuǎn)染至大鼠腎小管細胞CI-AKI 模型細胞HK-2中,分別為pcDNA3.1-PC-3.1組、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-PC-3.1組、LncRNA XLOC_036125 siRNA control 組、LncRNA XLOC_036125 siRNA 組、pcDNA3.1-pc-3.1組、pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1 組、Lgmn siRNA NC組、Lgmn siRNA組 。取對數(shù)期生長細胞，重選調(diào)整濃度，按1.5×105個/孔接種于6孔板中，待細胞生長狀態(tài)良好達70%～80%融合時進行轉(zhuǎn)染。分別配制a液(240 μl無血清無抗生素培養(yǎng)基+10 μl脂質(zhì)體)、 b液(240 μl無血清無抗生素培養(yǎng)基+4 μg質(zhì)粒/100 pmol siRNA)、c液(b液+a液)，充分混勻，室溫靜置待用。常規(guī)細胞換液后，加入1.5 ml無血清無抗生素培養(yǎng)基，均勻滴加c液后，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，更換完全培養(yǎng)基。

1.2.4RT-qPCR實驗 各組細胞總RNA提取采用Trizol法，用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，參照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明進行RT-PCR。反應(yīng)程序：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，收集熒光信號，計算相對定量結(jié)果，求出各組細胞中Lgmn、Beclin-1表達水平。

所有試驗重復(fù)3次，各標本目的基因和管家基因GAPDH的表達量的有關(guān)數(shù)據(jù)記為Ct值，Ct值的含義是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到所設(shè)定的閾值時經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)。以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。Lgmn、Beclin-1引物及管家基因GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。

1.2.5Western印跡實驗 待各組細胞融合度達90%以上，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后，使用含有Halt蛋白抑制劑的裂解液，置冰上裂解30 min，收集細胞置于4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，-80℃保存。使用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量，根據(jù)標準曲線計算蛋白含量。各組以30～60 μg相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳完成后，使用半干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后用1%脫脂牛奶稀釋Lgmn、Beclin-1一抗，4℃孵育過夜。次日使用TBST洗脫一抗，再37℃孵育二抗1 h，最后使用化學(xué)發(fā)光劑進行顯影。

1.2.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?使用TargetScan (http：//www.targetscan.org)和microRNA.org-Targets and Expression (http：//www.microrna.org)數(shù)據(jù)庫預(yù)測XLOC_036125和Lgmn結(jié)合區(qū)域。將Lgmn的XLOC_036125預(yù)測靶點序列或突變序列3′-UTR構(gòu)建于pmirGLO載體。突變序列以正常Lgmn的3′-UTR序列為模板，在與XLOC_036125相結(jié)合的預(yù)測位點進行點突變。將LncRNA XLOC_036125穩(wěn)定過表達重組表達質(zhì)粒、空載體對照質(zhì)粒及LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA分別與所構(gòu)建的載體同時利用DharmFECT Duo試劑進行轉(zhuǎn)染待測細胞，分別為LncRNA XLOC_036125 siRNA control 組、LncRNA XLOC_036125 siRNA 組、Lgmn siRNA NC 組、Lgmn siRNA組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用Dual-Glo Luciferase分析系統(tǒng)分析實驗結(jié)果。具體按雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書操作。

1.2.7GST-pull down ChIP 實驗 將編碼蛋白A與GST 的重組質(zhì)粒化轉(zhuǎn)BL21菌株，挑取單個克隆到含有5 ml LB(+100 μg/ml Amp)的10 ml試管里，37℃培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500 ml LB(+100 μg/ml Amp)的1 L錐形瓶中，37℃，225 r/min培養(yǎng)至OD600 nm 1.0～1.5，加入適當濃度的IPTG，在適當溫度下培養(yǎng)適當時間，3 000 r/min，10 min，4℃離心收集細菌，去盡上清。每500 ml培養(yǎng)液加入10～20 ml細菌裂解液(PBS+1%Triton-100+PMSF)，吹打混勻。冰上超聲破碎，開2 s，停9 s，總40～60 min。至裂解液充分清涼。11 000 r/min，15 min，4℃離心分離上清，-80℃保存?zhèn)溆?。將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標簽蛋白的真核表達載體上，細胞轉(zhuǎn)染48 h后，取適量融合蛋白GST-A冰上凍融。取50～70 μl GST-Beads到EP管中，用800 μl PBS+1%Triton-100潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1 h。PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。同時，裂解真核融合蛋白B，吹打收集至1.5 ml EP管，超聲破碎。13 000 r/min，15 min，4℃離心取上清。4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。40 μl 5×上樣緩沖液溶解beads上的蛋白，煮沸3 min，高速離心，Run-SDS PAGE做Western印跡檢測進行驗證。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進行兩獨立樣本t檢驗、近似t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA XLOC_036125 對Lgmn基因及蛋白表達水平的影響 RT-PCR實驗結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組(1.02±0.02)比較，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1組質(zhì)粒組HK-2細胞中，Lgmn mRNA 表達水平明顯增高(5.74±0.21，P<0.05)，與LncRNA XLOC_036125 siRNA control組(1.09±0.05)比較，LncRNA XLOC_036125 siRNA.1組HK-2細胞中，Lgmn mRNA表達水平則明顯降低(0.41±0.02，P<0.05)。Western印跡實驗結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組比較，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3組HK-2細胞中，Lgmn 蛋白表達水平明顯較高(1.02±0.02 vs 2.83±0.17,P<0.05)，與LncRNA XLOC_036125 siRNA control組比較，LncRNA XLOC_036125 siRNA組HK-2細胞中，Lgmn 蛋白表達水平明顯較低(1.06±0.03 vs 0.35±0.03，P<0.05)，見圖1。

1～4：pcDNA3.1-pc-3.1組、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1組、LncRNA XLOC_036125 siRNA control組、LncRNA XLOC_036125 siRNA組

2.2LncRNA XLOC_036125 和 Lgmn 靶向作用分析 LncRNA XLOC_036125與 Lgmn 3′UTR存在結(jié)合位點(圖2)。轉(zhuǎn)染野生型Lgmn熒光報告載體的HK-2細胞中，LncRNA XLOC_036125 siRNA組細胞熒光活性明顯低于LncRNA XLOC_036125 siRNA control組細胞(0.32±0.04 vs 1.00±0.00,P<0.05)。LncRNA XLOC_036125與 Lgmn存在直接靶向作用關(guān)系。

圖2 LncRNA XLOC_036125 和 Lgmn 靶向作用分析

2.3Lgmn 蛋白與 Beclin-1 蛋白靶向作用 GST-pull down ChIP 實驗結(jié)果顯示，在HK-2細胞中，與陽性對照組比較，Lgmn 蛋白與 Beclin-1 蛋白存在直接結(jié)合的作用關(guān)系。見圖3。

圖3 Lgmn 蛋白與 Beclin-1 蛋白靶向作用

2.4Lgmn 對 Beclin-1 基因及蛋白表達水平的影響 RT-PCR實驗結(jié)果及Western印跡實驗結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組比較，pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1組HK-2細胞中，Beclin-1 mRNA 及蛋白表達水平均明顯增高(P<0.05)，與Lgmn siRNA NC組比較，Lgmn siRNA組HK-2細胞中，Beclin-1 mRNA 及蛋白表達水平則均明顯降低(P<0.05)。見表1、圖4。

1～4：pcDNA3.1-pc-3.1組、pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1組、Lgmn siRNA NC組、Lgmn siRNA組

表1 Lgmn 對 Beclin-1 基因表達水平的影響

2.5LncRNA XLOC_036125 對 Beclin-1 基因及蛋白表達水平的影響 RT-PCR實驗結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組比較，pcDNA3.1-pc-Lgmn-pc-3.1組HK-2細胞中，Beclin-1 mRNA 表達水平明顯增高(1.04±0.03 vs 7.73±0.31,P<0.05)；與Lgmn siRNA NC組比較，Lgmn siRNA組HK-2細胞中，Beclin-1 mRNA 表達水平則明顯降低(1.10±0.05 vs 0.32±0.03,P<0.05)。Western印跡實驗結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組比較，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1組HK-2細胞中，Beclin-1 蛋白表達水平也明顯較高(1.07±0.02 vs 3.42±0.20,P<0.05)；與LncRNA XLOC_036125 siRNA control組比較，LncRNA XLOC_036125 siRNA組HK-2細胞中，Beclin-1 蛋白表達水平也明顯較低(1.12±0.05 vs 0.52±0.07，P<0.05)。見圖5。

1～4：pcDNA3.1-PC-3.1組、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-PC-3.1組、LncRNA XLOC_036125 siRNA control組、LncRNA XLOC_036125 siRNA組

3 討 論

碘造影劑腎病指碘造影劑在血管內(nèi)給藥48～72 h內(nèi)出現(xiàn)的無其他原因的不能解釋的腎功能損害性疾病，以血清肌酐較基礎(chǔ)水平升高25%或絕對值升高≥0.5 mg/dl為診斷標準，其中以急性腎損傷在臨床中最為常見〔4〕。心血管疾病介入治療是目前臨床上治療冠心病的主要技術(shù)，盡管碘造影劑工藝發(fā)展迅速，但隨著接受碘造影劑影像學(xué)檢查和介入治療患者數(shù)的不斷增加，碘造影劑的應(yīng)用范圍越來越廣，其帶來的碘造影劑急性腎損傷患者總量也逐漸呈現(xiàn)出增多的趨勢，其臨床干預(yù)與治療也越來越受到關(guān)注。有研究比較不同手術(shù)引起碘造影劑急性腎損傷患者發(fā)生率發(fā)現(xiàn)，心臟造影術(shù)后患者并發(fā)碘造影劑急性腎損傷的發(fā)生率明顯高于非心臟造影術(shù)后患者，合并基礎(chǔ)腎臟疾病及腎功能不全患者的發(fā)生率則更高〔5，6〕。

有研究發(fā)現(xiàn)，碘造影劑急性腎損傷與炎癥因子的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥是導(dǎo)致碘造影劑急性腎損傷的主要原因之一〔7，8〕。一方面碘造影劑可引起細胞內(nèi)外液滲透壓不同，導(dǎo)致細胞內(nèi)液向細胞外轉(zhuǎn)移，干擾腎皮質(zhì)氧化，引起腎小管上皮細胞間質(zhì)水腫，破壞腎小管上皮細胞完整性，導(dǎo)致細胞骨架發(fā)生破壞，最終引起細胞死亡〔9〕，另一方面，碘造影劑還可在一定程度上引起短時間的腎血管擴張及長時間的腎血管收縮，介導(dǎo)舒血管物質(zhì)分泌減少，進而引起腎髓質(zhì)發(fā)生缺血缺氧，導(dǎo)致腎小管細胞出現(xiàn)損傷，甚至發(fā)生壞死〔10，11〕。隨著對碘造影劑急性腎損傷發(fā)生機制研究的不斷深入，近年來不斷有研究提升，在碘造影劑急性腎損傷缺血再灌注誘導(dǎo)期間及順鉑等腎毒性藥物干預(yù)過程中，腎小管近端管狀細胞均可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生〔12〕。自噬誘導(dǎo)是一個低氧應(yīng)激早期反應(yīng)，主要發(fā)生于管狀細胞凋亡之前，在體內(nèi)外腎缺血-再灌注模型中均可見大鼠近端小管細胞在缺氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬〔13，14〕。Beclin-1 是酵母自噬基因 6(Ap96/Vps30)在哺乳動物中的同源物，它是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子，其主要通過控制自噬體的形成，調(diào)節(jié)其他的自噬蛋白定位到前自噬體膜上，控制自噬體的形成，從而調(diào)節(jié)自噬活性，在自噬起始階段起重要作用〔15，16〕。本研究結(jié)果提示LncRNAs XLOC_036125 調(diào)控 Lgmn 與 Beclin-1表達，在一定程度上參與自噬過程的調(diào)節(jié)，在造影劑急性腎損傷中存在LncRNA XLOC_036125-Lgmn-Beclin-1軸作用。

綜上，在造影劑急性腎損傷中，LncRNA XLOC_036125可通過靶向結(jié)合Lgmn調(diào)控Lgmn及下游Beclin-1表達水平，參與HK-2細胞自噬調(diào)控作用。由于急性腎損傷中腎小管細胞自噬發(fā)生在凋亡之前，自噬主要是細胞應(yīng)激和凋亡的早期反應(yīng)，但此過程中自噬調(diào)節(jié)的具體作用仍存在爭議，LncRNA XLOC_036125-Lgmn-Beclin-1軸參與的自噬調(diào)節(jié)信號通路尚未完全明了，將在后續(xù)研究中深入探索。