劉文秀 吳彩斌 馮朵 王名姣

(榆林市星元醫(yī)院內(nèi)分泌腎病科，陜西 榆林 719000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是終末期腎病的常見(jiàn)病因。足細(xì)胞是高度特化和終末分化的上皮細(xì)胞，覆蓋腎小球基底膜表面，構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障，在維持選擇性腎小球?yàn)V過(guò)中起關(guān)鍵作用〔1〕。研究顯示，DN發(fā)生時(shí)，除腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張、腎小球硬化外，足細(xì)胞凋亡、結(jié)構(gòu)功能改變?cè)贒N進(jìn)展中具有重要作用，足細(xì)胞損傷是DN的早期病理表現(xiàn)〔2〕。因此，尋找抑制足細(xì)胞損傷的有效方法對(duì)DN的治療具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是單鏈的、長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，與包括DN在內(nèi)的多種人類(lèi)疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3,4〕。研究顯示DN患者腎組織、血清中DLX6反義RNA1(DLX6-AS1)表達(dá)上調(diào)，DLX6-AS1異常表達(dá)可能與DN患者腎功能下降、足細(xì)胞損傷有關(guān)，表明DLX6-AS1可能是DN發(fā)病機(jī)制中重要的調(diào)節(jié)因子〔5,6〕。然而，DLX6-AS1在DN中的確切作用并未完全闡明。本研究通過(guò)探討DLX6-AS1在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的作用，闡明其分子機(jī)制，以期為DN治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 小鼠永生化足細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；小鼠重組γ-干擾素購(gòu)于美國(guó)Biovision公司；Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；DLX6-AS1小干擾RNA(si-DLX6-AS1)及其陰性對(duì)照(si-NC)、miR-200a模擬物(miR-200a mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、實(shí)驗(yàn)引物、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由上海生工公司提供；PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Green Master Mix購(gòu)于大連Takara公司；兔源含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔IgG二抗購(gòu)于上海碧云天生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 復(fù)蘇足細(xì)胞后，采用含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、10 U/ml γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)液在33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。然后采用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，使足細(xì)胞分化成熟。使用前將足細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓處理24 h。分為正常糖組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高滲組(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高糖組(25.0 mmol/L葡萄糖)，干預(yù)48 h后，按照下述實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)腎病蛋白(nephrin)、結(jié)蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)、DLX6-AS1、miR-200a表達(dá)及足細(xì)胞凋亡情況。為驗(yàn)證DLX6-AS1調(diào)控miR-200a在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的作用，將足細(xì)胞分為以下幾組。si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC后進(jìn)行高糖處理)、si-DLX6-AS1組(轉(zhuǎn)染si-DLX6-AS1后進(jìn)行高糖處理)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC后進(jìn)行高糖處理)、miR-200a組(轉(zhuǎn)染miR-200a mimics后進(jìn)行高糖處理)、si-DLX6-AS1+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-DLX6-AS1和miR-NC后進(jìn)行高糖處理)、si-DLX6-AS1+miR-200a組(共轉(zhuǎn)染si-DLX6-AS1和miR-200a后進(jìn)行高糖處理)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48 h后再給予高糖刺激48 h。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞按照上述分組處理后，消化細(xì)胞，采用結(jié)合緩沖液調(diào)整為單細(xì)胞懸液。取100 μl細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/ml)，分別加入10 μl的Annexin V/FITC、5 μl的PI在室溫條件下避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

1.4RT-qPCR檢測(cè) 利用TRIzol試劑從足細(xì)胞中提取總RNA，使用PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。以cDNA為模板，利用下述引物、SYBR Green Master Mix在A(yíng)BI 7900 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。用2-ΔΔCt法分析DLX6-AS1、miR-200a、nephrin、desmin、vimentin的表達(dá)水平。引物序列：DLX6-AS1正義鏈：5′-CCAAATGCTACCATCCAGCC-3′;反義鏈:5′TCTGGCTTCCCTTAACCAAAA-3′；GAPDH正義鏈:5′-CGACACTTTATCATGGCTA-3′;反義鏈:5′-TTGTTGCCGATCACTGAAT-3′；miR-200a正義鏈:5′-CACCGCCTCCCATTGTC-3′;反義鏈:5′-CACAGGAAGTCAGTTCAGACC-3′；U6正義鏈:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;反義鏈:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；nephrin正義鏈:5′-CTCGTGTCTCCCAGCGTAAT-3′;反義鏈:5′-AACTGTGCTTCCTGCCTCAG-3′；desmin正義鏈:5′-GTGAAGATGGCCTTGGATGT-3′;反義鏈:5′-GCTGGTTTCTCGGAAGTTGA-3′；vimentin正義鏈:5′-GATCAGCTCACCAACGACAA-3′;反義鏈:5′-GCTTTCGGCTTCCTCTCTCT-3′。

1.5Western印跡檢測(cè) 使用RIPA裂解緩沖液從足細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜2 h；將膜置于一抗溶液(caspase-3、GAPDH均按1∶1 000稀釋?zhuān)?中室溫條件下孵育2 h；洗滌后，將膜置于二抗溶液(1∶1 000稀釋)中室溫條件下孵育2 h；洗滌后，進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色；以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件對(duì)目的條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將含有與miR-200a存在結(jié)合位點(diǎn)的DLX6-AS1野生型序列或含有miR-200a結(jié)合位點(diǎn)的DLX6-AS1突變型序列克隆到熒光素酶報(bào)告載體，構(gòu)建野生型/突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(WT/MUT-DLX6-AS1)，該過(guò)程由上海吉瑪制藥公司完成。利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將WT-DLX6-AS1、MUT-DLX6-AS1分別與miR-200a mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)測(cè)定各組細(xì)胞熒光素酶活性。同時(shí)將si-NC、si-DLX6-AS1分別轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)按照1.4步驟檢測(cè)miR-200a表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t軟件檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1DLX6-AS1在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中的表達(dá) 與正常糖組比較，高糖組足細(xì)胞desmin和vimentin mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、DLX6-AS1表達(dá)顯著升高，nephrin mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

表1 DLX6-AS1在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中表達(dá)

圖1 高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響

2.2抑制DLX6-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin表達(dá)的影響 與si-NC組比較，si-DLX6-AS1組足細(xì)胞DLX6-AS1表達(dá)、desmin和vimentin mRNA表達(dá)、凋亡率、caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，nephrin mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2、圖3、表2。

圖2 抑制DLX6-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響

圖3 caspase-3蛋白表達(dá)

表2 抑制DLX6-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin mRNA表達(dá)的影響

2.3DLX6-AS1靶向miR-200a 生物信息學(xué)軟件在線(xiàn)預(yù)測(cè)顯示，DLX6-AS1與miR-200a之間存在部分連續(xù)互補(bǔ)的核苷酸序列。見(jiàn)圖4。雙熒光素酶活性檢測(cè)顯示，miR-200a和WT-DLX6-AS1共轉(zhuǎn)染組足細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC和WT-DLX6-AS1共轉(zhuǎn)染組顯著降低(0.41±0.05 vs 1.04±0.11；t=15.642，P=0.000)；miR-200a和MUT-DLX6-AS1共轉(zhuǎn)染組足細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC和MUT-DLX6-AS1共轉(zhuǎn)染組無(wú)顯著變化(1.03±0.12 vs 1.05±0.13；t=0.339,P=0.739)。RT-qPCR檢測(cè)顯示，si-DLX6-AS1組足細(xì)胞miR-200a表達(dá)水平較si-NC組顯著升高(3.28±0.35 vs 1.02±0.13；t=18.159,P=0.000)。

圖4 DLX6-AS1靶向miR-200a

2.4miR-200a對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin mRNA表達(dá)的影響 與miR-NC組比較，miR-200a組足細(xì)胞miR-200a和nephrin mRNA表達(dá)顯著升高，desmin和vimentin mRNA表達(dá)、凋亡率、caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖5、圖6。

表3 miR-200a對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin mRNA表達(dá)的影響

圖5 miR-200a對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡

圖6 Western印跡檢測(cè)caspase-3蛋白表達(dá)

2.5miR-200a可增強(qiáng)抑制DLX6-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響 與si-DLX6-AS1+miR-NC組比較，si-DLX6-AS1+miR-200a組足細(xì)胞miR-200a表達(dá)顯著增加，凋亡率、caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖7、圖8、表4。

圖7 miR-200a可增強(qiáng)抑制DLX6-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響

1～2：si-DLX6-AS1+miR-NC組，si-DLX6-AS1+miR-200a組

2.6miR-200a可增強(qiáng)抑制DLX6-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中nephrin、desmin、vimentin mRNA表達(dá)的影響 與si-DLX6-AS1+miR-NC組比較，si-DLX6-AS1+miR-200a組足細(xì)胞nephrin mRNA表達(dá)顯著升高，desmin和vimentin mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 miR-200a可增強(qiáng)抑制DLX6-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin表達(dá)的影響

3 討 論

近年來(lái)lncRNA在DN中的作用被逐步揭示。研究顯示lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟中表達(dá)上調(diào)，抑制MALAT1可減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷〔7〕。lncRNA SOX2基因重疊轉(zhuǎn)錄本(SOX2OT)通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、提高細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡可顯著高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷〔8〕。此外，lncRNA 母系表達(dá)基因(MEG)3通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可降低足細(xì)胞遷移能力、抑制活性氧生成進(jìn)而改善DN足細(xì)胞損傷〔9〕。DLX6-AS1是一種新型lncRNA，目前對(duì)DLX6-AS的研究主要集中在腫瘤方面〔10，11〕，其在DN中作用并未闡明。

本研究首次探討了DLX6-AS1在DN中對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)后足細(xì)胞DLX6-AS1表達(dá)顯著增加，與史嫣〔5〕研究結(jié)果吻合，提示DLX6-AS1異常表達(dá)在DN進(jìn)展中具有重要作用。caspase-3細(xì)胞凋亡發(fā)生的最終執(zhí)行因子，進(jìn)一步功能分析顯示，高糖誘導(dǎo)可促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，提高caspase-3蛋白表達(dá)水平，而抑制DLX6-AS1表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)對(duì)足細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用。nephrin是一種重要的狹縫隔膜蛋白，在足細(xì)胞中協(xié)調(diào)細(xì)胞連接和細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的作用，其表達(dá)缺失可導(dǎo)致蛋白質(zhì)濾過(guò)能力喪失，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生，nephrin表達(dá)降低被認(rèn)為是DN足細(xì)胞損傷的重要特征〔12〕。vimentin和desmin為細(xì)胞骨架中間絲蛋白，vimentin分布在細(xì)胞核、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器邊緣，對(duì)于維持細(xì)胞骨架和完整性具有重要作用。研究指出，在足細(xì)胞損傷時(shí)往往伴有vimentin、desmin表達(dá)增加，失去上皮細(xì)胞特征發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化〔13,14〕。本研究結(jié)果提示，DLX6-AS1異常表達(dá)可能是導(dǎo)致DN足細(xì)胞凋亡、損傷的重要因素。

研究表明，lncRNA通過(guò)靶向miRNA在調(diào)控各種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔15〕。例如，LncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本(NEAT)1通過(guò)與miR-23c相互作用可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖、纖維化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡〔16〕。lncRNA癌易感性候選基因(CASC)2通過(guò)下調(diào)miR-133b可降低高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞外基質(zhì)積累〔17〕。本研究中miR-200a被選定為DLX6-AS1下游靶基因，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)DLX6-AS1對(duì)miR-200a的靶向負(fù)調(diào)控功能作用。既往研究表明，miR-200a可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞Wnt/β-catenin通路活化，促進(jìn)nephrin表達(dá)從而減輕足細(xì)胞損傷〔18〕。miR-200a還可緩解腎間質(zhì)纖維化〔19〕。此外，有研究指出新型姜黃素同源物C66對(duì)小鼠糖尿病腎病的保護(hù)作用可能與上調(diào)miR-200a表達(dá)有關(guān)〔20〕。與上述研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-200a可減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，降低caspase-3、vimentin、desmin表達(dá)，并升高nephrin表達(dá)水平。此外，進(jìn)一步研究顯示過(guò)表達(dá)miR-200a還可增強(qiáng)si-DLX6-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡、損傷的保護(hù)作用。

綜上，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中DLX6-AS1表達(dá)上調(diào)，抑制DLX6-AS1通過(guò)靶向miR-200a可減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，這為DN的治療提供了新的思路。