李立恒 周軍 張敏 王芹 安峰 張麗娟 汪佳 張凡

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000；2張家口市第一醫(yī)院口腔科；3張家口學(xué)院臨床學(xué)院；河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 4小兒外科；5病理科)

人涎腺腺樣囊性癌是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，占涎腺上皮性腫瘤的8%～10%，可發(fā)生于任何年齡，易發(fā)生于腮腺、頜下腺、舌下腺等，具有神經(jīng)周圍浸潤特征，容易侵入神經(jīng)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔1～4〕。目前，人涎腺腺樣囊性癌的治療方式主要是手術(shù)，但療效不太理想且復(fù)發(fā)率及患者不良預(yù)后率較高。微小RNA(miRNA)可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮功能、調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)行為，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-455在胃癌〔6〕、宮頸癌〔7〕、結(jié)腸癌〔8〕等腫瘤細(xì)胞中異常降低。線粒體促凋亡分子絲氨酸蛋白酶(Omi/HtrA2)是新發(fā)現(xiàn)的線粒體促凋亡因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用〔9,10〕。高鳳蘭等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，Omi/HtrA2基因過表達(dá)對食管癌細(xì)胞有明顯抑制作用，且可明顯提高癌細(xì)胞凋亡率。以往關(guān)于miR-455、Omi/HtrA2單獨(dú)在宮頸癌、胃癌、食管癌等腫瘤中研究較多，而在人涎腺腺樣囊性癌中鮮有報(bào)道，因此，本研究以人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(ACC-M)為研究對象，分析miR-455對Omi/HtrA2介導(dǎo)的人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株線粒體凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 收集2017年8月至2019年3月在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院70例因原發(fā)病手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷為人涎腺腺樣囊性癌患者的癌組織(其中腮腺39例，頜下腺20例，舌下腺11例)為人涎腺腺樣囊性癌組，男33例，女37例，年齡23～75歲，平均年齡(52.19±12.36)歲；選取正常涎腺組織65例(來源于同期醫(yī)院頜面部骨折手術(shù)患者)為對照組，男29例，女36例，年齡25～73歲，平均年齡(50.68±10.59)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.449),具有可比性。無菌操作下取得的新鮮組織放入無菌凍存管后迅速投入液氮中快速冷凍，再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱長期保存。人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(ACC-M)購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。

1.2主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基(批號NBG1236)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(批號36G5782)購自美國Gibco公司；鏈霉素(批號NBG-236)、青霉素(批號FH6-73J)、二甲基亞砜(DMSO，批號17003-032)購自美國sigma公司；蛋白提取試劑盒(批號ME861R)、BCA試劑盒(批號2763DB)、胰蛋白酶(批號BD735N)、瓊脂糖、溴化乙錠、LipofectamineTM3000、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(貨號HUDY03)均購自上海碧云天公司；羊抗人ki67抗體(批號JD-2847)、Omi/HtrA2(批號YB-S903)抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體(批號XIN-56)、caspase-6抗體(批號XMN-68)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(批號674GN6)購自美國Proteintech公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號7856GU)購自美國Sigma公司)；Trizol Reagent核酸分離試劑(批號83H296)購自日本TaKaRa公司；AceQqPCR SYBR Green Mix(批號NC9343)購自南京vazyme生物公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，批號MC34063)、Al-exa Fluor594(批號ab150169)、Alexa Fluor 488(批號SY0602)購于Invitrogen公司；細(xì)胞色素C(批號140670)、線粒體抗體(NM8493)購于英國Abcam公司；CO2培養(yǎng)箱(型號NHD DYE1738)購自日本sanyo公司；倒置熒光顯微鏡(型號BNJD7836)購自美國Olympus公司；Elx800 酶標(biāo)儀(型號HSG9832)購自美國Thermo公司)；熒光定量PCR儀(型號HDBC0291)購自Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞復(fù)蘇 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)消毒，紫外照射30 min，從液氮罐中取出無菌凍存管迅速轉(zhuǎn)到40℃水浴中，輕輕振蕩至凍存液完全融化，將細(xì)胞懸液移入離心管中，加入含15%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，離心(3 000 r/min、5 min)，沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的ACC-M細(xì)胞株在37℃，5%CO2、飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含15%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，每3 d換液1次，待細(xì)胞生長密度達(dá)80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 收集1.3.2中對數(shù)生長期的ACC-M細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板上(5.0×104個(gè)/孔)，采用LipofectamineTM3000法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后用RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為3組：稀釋miR-455 mimics：250 μl無血清培養(yǎng)基RPMI1640稀釋10 μl的20 μmol/L的miR-455 mimics、miR-455-NC儲(chǔ)存液室溫孵育5 min。稀釋LipofectamineTM3000：50 μl無血清培養(yǎng)基RPMI1640稀釋5 μl LipofectamineTM3000，混勻室溫孵育5 min。將LipofectamineTM3000分別與miR-455 mimics(miR-455 mimics組)、miR-455-NC(陰性對照組)混合，靜置20 min，加入培養(yǎng)孔，輕輕混勻。以未經(jīng)處理只加入500 μl RPMI1640培養(yǎng)基的細(xì)胞為空白對照組。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞上清液待測。

1.3.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-455水平 取出超低溫冰箱內(nèi)保存的人涎腺腺樣囊性癌組織、正常涎腺組織及1.3.3中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的空白對照組、陰性對照組、miR-455 mimics組細(xì)胞采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以RNA為模板，按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系20 μl：2×UltraSYBR mixture 10.0 μl，cDNA模板(25 ng/μl)2.0 μl，上下游引物各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl；反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由大連寶生生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，miR-455以U6作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算人涎腺腺樣囊性癌組織、正常涎腺組織miR-455 mRNA及各組細(xì)胞中miR-455 mRNA相對表達(dá)量。引物：反向引物5′-3′U6正向引物：5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，反向：5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′；miR-455正向引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.3.5MTT法檢測ACC-M細(xì)胞增殖能力 取1.3.3各組穩(wěn)定表達(dá)miR-455的ACC-M細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)孔細(xì)胞密度為5×104個(gè)，分別培養(yǎng)24、48、72 h后向各孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀中570 nm處測定各孔細(xì)胞光密度(OD)，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6流式細(xì)胞儀PI染色法檢測miR-455對細(xì)胞凋亡的影響 收集1.3.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染48 h后的各組ACC-M細(xì)胞，使用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，棄上清，并調(diào)節(jié)濃度至1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl細(xì)胞懸液加入5 μl的AnnexinV/FITC及10 μl濃度為20 μg/ml的PI混勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。每組均設(shè)6個(gè)重復(fù)。

1.3.7免疫熒光檢測細(xì)胞色素C釋放及光密度情況 將爬片放入24孔板中接種細(xì)胞，12 h后轉(zhuǎn)染，用含200 μg/ml氟尿嘧啶(5-Fu)的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后收集爬片，PBS洗3次(5 min/次)，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS洗3次(5 min/次)，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(Tri-tonX-100)室溫通透10 min，PBS洗3次(5 min/次)，胎牛血清封閉30 min，加一抗細(xì)胞色素C(鼠抗1∶1 000)、線粒體(兔抗1∶800)室溫避光孵育3 h，PBST洗3次(5 min/次)，避光孵育二抗琥珀酰亞胺酯(AlexaFluor594，抗兔1∶1 500)、Alexa Fluor488(抗鼠1∶2 000)30 min，PBST洗3次(5 min/次)，DAPI封片、避光4℃保存，鏡下觀察并拍照。用Image J軟件半定量分析熒光強(qiáng)度。

1.3.8Western印跡檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白表達(dá)變化 收集1.3.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染48 h后的ACC-M細(xì)胞，PBS洗滌2次后，加入1%Triton裂解液，于冰上裂解30 min，在離心機(jī)上15 000 r/min離心20 min，取上清，通過蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA蛋白試劑盒測定細(xì)胞中總蛋白含量，蛋白樣品10～20 μl，經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在加入含5%脫脂奶粉的吐溫-20-三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液(TBST)溶液室溫下封閉1 h后；加入羊抗人ki67抗體(1∶1 000)、Omi/HtrA2抗體(1∶1 000)、caspase3抗體(1∶1 000)、caspase6抗體(1∶1 000)、β-actin作為一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔(1∶5 000)作為二抗，室溫下震蕩1 h后，用TBST洗1遍，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色后曝光顯影，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照并進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以β-actin為內(nèi)參分析ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相對表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1對照組及人涎腺腺樣囊性癌組中miR-455表達(dá)水平比較 與對照組(1.07±0.20)相比，人涎腺腺樣囊性癌組miR-455表達(dá)顯著降低(0.50±0.11；t=20.299，P=0.000)。

2.2空白對照組、陰性對照組及miR-455 mimics組轉(zhuǎn)染效果檢測 miR-455 mimics組ACC-M細(xì)胞中miR-455表達(dá)水平顯著高于空白對照組、陰性對照組(1.42±0.23、0.87±0.19、0.88±0.19，P<0.05)，而空白對照組、陰性對照組無顯著性差異(P>0.05)。

2.3過表達(dá)miR-455對ACC-M細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對照組相比，陰性對照組各時(shí)間點(diǎn)OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-455 mimics組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h后OD值顯著降低(P<0.05)；與陰性對照組相比，miR-455 mimics組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h OD值顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組不同時(shí)間細(xì)胞增殖情況

2.4miR-455過表達(dá)對ACC-M細(xì)胞凋亡的影響 與空白對照組相比，陰性對照組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-455 mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與陰性對照組相比，miR-455 mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 3組細(xì)胞凋亡情況

圖1 3組細(xì)胞凋亡情況

2.5免疫熒光檢測細(xì)胞色素C釋放情況 熒光免疫結(jié)果顯示，與空白對照組、陰性對照組比較，miR-455 mimics組細(xì)胞色素C呈彌散性分布于細(xì)胞質(zhì)中，圍繞在細(xì)胞核周圍，見圖2；細(xì)胞色素C、線粒體平均光密度顯著升高(P<0.05)，見表3。

圖2 熒光免疫檢測熒光色素釋放情況(×100)

2.6miR-455過表達(dá)對增殖蛋白ki67、線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Omi/HtrA2、caspase3、caspase6表達(dá)的影響 與空白對照組比較，陰性對照組ACC-M細(xì)胞中ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-455 mimics組ACC-M細(xì)胞中ki67蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與陰性對照組比較，miR-455 mimics組ACC-M細(xì)胞中ki67蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 3組細(xì)胞色素C、線粒體平均光密度及ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相對表達(dá)量比較

1～3:空白對照組、陰性對照組、miR-455 mimics組

3 討 論

成熟miRNA是長度為20～23個(gè)核苷酸(nt)的單鏈RNA分子，是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑，通常會(huì)降低mRNA穩(wěn)定性，包括介導(dǎo)腫瘤發(fā)生過程基因的mRNA，可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮功能、調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)行為〔12,13〕。李平等〔14〕研究顯示，與慢性宮頸炎組比較，宮頸癌組組織miR-455表達(dá)水平顯著降低，提示miR-455可能在宮頸癌中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究結(jié)果提示miR-455可能與人涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病有關(guān)，其有可能同樣在人涎腺腺樣囊性癌中發(fā)揮抑癌基因作用；提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，可供后續(xù)試驗(yàn)。癌細(xì)胞除增殖迅速外，凋亡能力減弱也是癌細(xì)胞發(fā)展迅速的重要原因。本研究流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示miR-455過表達(dá)可能促進(jìn)ACC-M細(xì)胞凋亡。

線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控的活動(dòng)中心，在凋亡因子的刺激下，線粒體釋放出不同促凋亡因子，激活細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白酶〔15〕。Omi/HtrA2是由一種絲氨酸蛋白酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后由線粒體定向序列/線粒體定位信號(MTS/MLS)引導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，通過自身蛋白酶解或被線粒體加工肽酶降解形成成熟Omi分子〔16，17〕。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激反應(yīng)時(shí)，線粒體膜通透性增加，進(jìn)一步使Omi/HtrA2分子從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)而發(fā)揮促凋亡作用〔18〕。caspase3是線粒體凋亡途徑關(guān)鍵執(zhí)行者，當(dāng)線粒體釋放凋亡蛋白(如細(xì)胞色素C、Omi/HtrA2)時(shí)，引起caspase6活化，進(jìn)一步發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，引起caspase3活化，導(dǎo)致DNA斷裂發(fā)生凋亡〔19〕。本研究免疫熒光檢測細(xì)胞色素C釋放情況，提示miR-455過表達(dá)可促進(jìn)線粒體凋亡，過表達(dá)miR-455可能通過激活Omi/HtrA2介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑促進(jìn)人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上，miR-455可能通過Omi/HtrA2介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑促進(jìn)人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞發(fā)生凋亡。但是本研究未能明確miR-455在人涎腺腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制，后期仍需進(jìn)一步研究。