李前輝 謝小娟 郭浩翔 張宜林

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽 471023)

腦缺血再灌注(I/R) 損傷是最具破壞性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，它是由流向腦組織的血流減少和隨后的再灌注引起的〔1〕。低血壓、心搏驟停、冠狀動脈搭橋或缺血性腦卒中等多種危險因素均可導(dǎo)致I/R的發(fā)生〔2〕。目前，I/R的發(fā)生率呈上升趨勢，仍然是世界范圍內(nèi)致殘和死亡的主要原因之一，并造成沉重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔3〕，然而，這種疾病仍然缺乏有效的治療方法。I/R可引起神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激等多種有害的病理變化，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的發(fā)生〔4〕。因此，需要確定缺血引起的腦損傷的分子機(jī)制，并開發(fā)出有效的療法以應(yīng)對缺血性引起的相關(guān)疾病。七氟烷(Sevo)是一種具有最小刺激性的新型揮發(fā)性麻醉劑。研究發(fā)現(xiàn)，在體外和體內(nèi)，七氟烷誘導(dǎo)預(yù)處理對腦缺血神經(jīng)元損傷均具有保護(hù)作用〔5〕。雖然Sevo在大腦中的神經(jīng)保護(hù)作用已被闡明，但I(xiàn)/R中Sevo預(yù)處理的確切分子機(jī)制仍然未知。MicroRNAs (miRNAs)是一種內(nèi)源性編碼的非編碼小RNA，越來越多的證據(jù)表明，各種miRNA在I/R中失調(diào)，可以作為潛在的診斷或治療靶點(diǎn)〔6,7〕。各種研究表明,在IR損傷的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校邢蛱禺愋詍iRNA可以減輕神經(jīng)元損傷，恢復(fù)神經(jīng)功能〔8～10〕。研究表明，miR-148b-3p在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活率方面起著重要的作用〔11,12〕。據(jù)報道，Sevo參與大腦和周圍組織中多種miRNA的調(diào)節(jié)〔13〕。但是，關(guān)于I/R進(jìn)行Sevo預(yù)處理的miR-148b-3p調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究探討Sevo預(yù)處理介導(dǎo)miR-148b-3p在體內(nèi)對I/R的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選用45只SPF級健康成年雄性SD大鼠，鼠齡為7～9個月，體重250～300 g，恒定室溫(23±1)℃，12 h光照/12 h黑暗，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2主要藥物和試劑 Sevo購自美國Sigma-Aldrich公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Selleck Chemicals公司；蘇木素-伊紅(HE)染液購自南京建成生物工程研究所；熒光素酶檢測試劑盒購自Solarbio公司；Lipofectamine 3000試劑、TRIzol試劑和Super RT cDNA試劑盒購自美國Invitrogen公司；兔抗大鼠雙特異性磷酸酶(DUSP)1單克隆抗體、兔抗大鼠(cleaved caspase)-3單克隆抗體、兔抗大鼠cleaved caspase-9單克隆抗體和兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動物分組與模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)(Sham)組、大腦中動脈閉塞(MCAO)組、MCAO+miR-148b-3p antagomir組、Sevo組和antagomir+Sevo組，每組9只。MCAO+miR-148b-3p antagomir組在MCAO之前，將7 μl(20 nmol/L)的miR-148b-3p拮抗劑注入右腦室10 min；Sevo組：在MCAO之前，將大鼠用2.5%的Sevo連續(xù)預(yù)處理4 d，30 min/d；antagomir+Sevo組。通過腹膜內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉大鼠，將尼龍絲(直徑約為0.24 mm)插入右頸總動脈中，并穿過頸總內(nèi)動脈，直到阻塞大腦中動脈。閉塞2 h后，將尼龍細(xì)絲抽出以重新供應(yīng)血流，以實(shí)現(xiàn)24 h的再灌注。用電子加熱墊將直腸溫度保持在正常溫度范圍內(nèi)(37±0.2)℃。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行相同的手術(shù)程序，不阻塞大腦中動脈。在MCAO 形成2 h和再灌注24 h后，通過脫頸處死大鼠取腦，切除嗅球、小腦和低位腦干部分，將腦組織冷凍在液氮中。

1.2.2RT-PCR MCAO組分別用miR-148b-3p antagomir或Sevo單獨(dú)或聯(lián)合處理后，所有大鼠處死并取左側(cè)海馬組織，使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過超微紫外光分光光度計(jì)在260和280 nm處測定吸光度。按照試劑盒說明書，使用Super RT cDNA試劑盒合成cDNA，之后進(jìn)行real time RT-PCR。取1 μl cDNA為模板加入2×SYBR Green qPCR預(yù)混液5 μl，配制10 μl PCR體系。miR-148b-3p 上游引物：5′-GCAGTCAGTGCATCACAGA-3′，下游：5′-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTACAAAG-3′；β-actin上游引物：5′-CGTGCGTGACATC AAAGAGAA-3′，下游：5′-TGGATGCCACAGGATTCCAT-3′。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)30次，72℃延長5 min。按照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-148b-3p表達(dá)量。

1.2.3HE染色 取部分大腦皮層組織放入含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS)進(jìn)行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、連續(xù)切片，切片厚度為4 μm；進(jìn)行HE染色，將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、100%、95%、90%、80%和70%的酒精各10 min，自來水沖洗；蘇木素染色、伊紅染色；由低到高濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學(xué)顯微鏡拍照，觀察其形態(tài)特征。

1.2.4Western印跡 每組各取5只大鼠，脫頸處死大鼠后取大鼠皮層組織，加入200 μl含0.01 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，冰上超聲裂解后12 000 r/min離心30 min，并用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。每孔上樣蛋白量為50 μg，于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入兔抗DUSP1單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗cleaved caspase-3單克隆抗體(1∶1 000)和兔抗cleaved caspase-9單克隆抗體(1∶1 000)于4℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入對應(yīng)HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)室溫下繼續(xù)孵育2 h，PBST洗膜3次，每次5 min，最后滴加ECL，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.2.5熒光素酶報告實(shí)驗(yàn) 通過PCR擴(kuò)增出含有miR-148b-3p結(jié)合位點(diǎn)的DUSP1 3′UTR序列，將該序列克隆到pGL3-basic載體中,命名為pGL3-DUSP1 3′UTR載體。通過基因定點(diǎn)誘變構(gòu)建出pGL3-DUSP1 3′UTR mut載體，作為陰性對照，然后利用Lipofectamine3000將pGL3-DUSP1 3′UTR或pGL3-DUSP1 3′UTR mut載體與miR-148b-3p mimic或mimic NC，連同pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染至皮層神經(jīng)元細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Sevo對腦缺血再灌注損傷大鼠中miR-148b-3p和DUSP1表達(dá)的影響 與Sham組相比，miR-148b-3p mRNA水平隨再灌注處理時間的增加而增加(P<0.05)；DUSP1蛋白表達(dá)水平隨灌注處理時間的增加而降低(P<0.05)。見圖1、表1。與Sham組相比，MCAO組miR-148b-3p mRNA水平升高(t=1.948，P<0.05)；DUSP1蛋白表達(dá)水平降低 (t=1.279，P<0.05)。與MCAO組相比，miR-148b-3p antagomir組、Sevo組和antagomir+Sevo組miR-148b-3p mRNA水明顯降低(F=45.83，P<0.05)；DUSP1蛋白表達(dá)水平明顯升高 (F=66.48，P<0.05)。見圖2、表2。

圖1 再灌注處理24 h后DUSP1蛋白表達(dá)水平

表1 再灌注處理24 h后miR-148b-3p mRNA和DUSP1蛋白表達(dá)

1～5:Sham組,MCAO組,miR-148b-3p antagomir組,Sevo組、anagomir+Sevo組，圖5同

2.2Sevo對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)損傷和腦損傷的影響 與Sham組相比，MCAO組犯錯次數(shù)、神經(jīng)功能評分和腦含水量均升高 (t=1.500、1.084、7.364，均P<0.05)；與MCAO組相比，miR-148b-3pantagomir組、Sevo組和antagomir+Sevo組犯錯次數(shù)、神經(jīng)功能評分和腦含水量均降低(P<0.05)。與Sham組相比，MCAO組新異臂進(jìn)入次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與MCAO組相比，miR-148b-3p antagomir組、Sevo組和antagomir+Sevo組新異臂進(jìn)入次數(shù)明顯增加(P<0.05)。見表2。通過HE染色檢測各組病理損傷程度見圖3，Sham組腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元胞核無固縮，散在小膠質(zhì)細(xì)胞；MACO組缺血區(qū)皮質(zhì)及基地節(jié)神經(jīng)元數(shù)量減少，排列紊亂，神經(jīng)元胞核固縮、顆粒細(xì)胞空泡性變，神經(jīng)纖維腫脹、小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤增多。miR-148b-3p antagomir組、Sevo組和antagomir+Sevo組腦組織缺血性損傷有明顯的改善。

圖3 HE染色檢測各組腦組織病理損傷程度(×400)

2.3Sevo對I/R損傷大鼠大腦皮層細(xì)胞凋亡的影響 與Sham組相比，MCAO組細(xì)胞凋亡率，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達(dá)水平均明顯升高 (t=1.359、1.405、1.349，P<0.05)；與MCAO組相比，miR-148b-3p antagomir組、Sevo組和antagomir+Sevo組MCAO組細(xì)胞凋亡率，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達(dá)水平均明顯降低 (F=39.58、23.54、31.24，P<0.05)。見表2，圖4、圖5。

表2 各組miR-148b-3p、DUSP1表達(dá)、犯錯次數(shù)、神經(jīng)功能評分、腦含水量和新入臂進(jìn)入次數(shù)及大腦皮層細(xì)胞凋亡比較

圖4 各組大腦皮層細(xì)胞凋亡的變化(×400)

圖5 凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9在大腦皮層組織中的表達(dá)變化

2.4miR-148b-3p和DUSP1的靶向關(guān)系 對照組、NC mimic組和miR-148b-3p mimic組中miR-148b-3p表達(dá)量分別為1.00±0.12、1.02±0.15和42.11±3.36。與對照組比較，miR-148b-3p mimic組miR-148b-3p水平顯著升高(t=1.049，P<0.05)。對照組、LV-vector組和LV-DUSP1組中DUSP1 mRNA的表達(dá)量分別為1.00±0.03、1.02±0.12和3.39±0.18。與對照組比較，LV-DUSP1組中DUSP1 mRNA水平顯著升高(t=1.837，P<0.05)。利用TargetScan網(wǎng)站生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DUSP1可能是miR-148b-3p的直接靶點(diǎn)(圖6)。熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DUSP1-WT+NC mimic組、DUSP1-WT+miR-148b-3p mimic組、DUSP1-MUT+NC mimic組和DUSP1-MUT++miR-148b-3p mimic組熒光素酶活性分別為1.89±0.13、1.16±0.15、1.92±0.18和1.95±0.14；與DUSP1-WT+NC mimic組比較，過表達(dá)miR-148b-3p導(dǎo)致DUSP1野生型3′UTR 報告基因的熒光素酶活性降低(t=4.178,P<0.05)。如圖7所示，對照組、miR-148b-3p mimic組、LV-DUSP1組和miR-148b-3p+DUSP1組DUSP1蛋白表達(dá)分別為0.75±0.16、0.08±0.03、2.14±0.18和0.82±0.12。與對照組比較，miR-148b-3p mimic組DUSP1蛋白表達(dá)水平顯著降低(t=1.239,P<0.05)，LV-DUSP1組DUSP1蛋白表達(dá)水平顯著升高(t=2.079,P<0.05)。與LV-DUSP1組比較，miR-148b-3p+DUSP1組DUSP1蛋白水平顯著降低(t=2.242,P<0.05)。

圖6 TargetScan預(yù)測miR-148b-3p與DUSP1靶向關(guān)系

1～4:Control組,miR-148b-3p mimic組,LV-DUSP1組,miR-148b-3p+DUSP1組

3 討 論

Sevo是一種較好的麻醉吸入性麻醉劑，廣泛應(yīng)用于臨床。Sevo預(yù)處理或早期后處理已被證明對缺血性腦損傷具有直接的神經(jīng)保護(hù)作用〔14〕。然而，Sevo預(yù)處理對I/R的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)Sevo預(yù)處理抑制了體內(nèi)和體外I/R實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭衜iR-148b-3p的表達(dá)。此外，miR-148b-3p過表達(dá)誘導(dǎo)的MACO處理大鼠缺血性腦損傷的神經(jīng)元細(xì)胞損傷增強(qiáng)，經(jīng)Sevo預(yù)處理后逆轉(zhuǎn)。此外， DUSP1被鑒定為miR-148b-3p的靶基因，而Sevo處理通過抑制miR-148b-3p，促進(jìn)DUSP1表達(dá)。結(jié)果表明，Sevo預(yù)處理可通過下調(diào)miR-148b-3p和上調(diào)DUSP1來防止I/R。

已有證據(jù)表明，超過20%的miRNAs在缺血腦中異常表達(dá)，并參與I/R發(fā)病和發(fā)展〔15〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-148b-3p過表達(dá)降低了氧糖剝奪/復(fù)氧(OGDR)暴露神經(jīng)元的細(xì)胞活力，加劇了細(xì)胞凋亡和活性氧的產(chǎn)生。相比之下，miR-148b-3p的抑制提高了OGDR暴露神經(jīng)元的細(xì)胞活力，減少了凋亡和活性氧的產(chǎn)生〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p在MCAO處理的大鼠大腦皮層神經(jīng)元中表達(dá)上調(diào)。此外，miR-148b-3p的抑制通過降低腦含水量，細(xì)胞凋亡率，增加新異臂進(jìn)入次數(shù)來減輕I/R大鼠模型的腦缺血，這與之前研究一致〔16〕。此外，Sun等〔11〕報道稱miR-148b-3p通過靶向SIRT7和調(diào)節(jié)p53介導(dǎo)的促凋亡信號，在體外調(diào)節(jié)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。miRNA在由預(yù)處理(如暴露于麻醉劑)引起的局部缺血耐受中起重要作用〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)發(fā)育早期暴露于Sevo會改變與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的miRNA表達(dá)，并可能引發(fā)大鼠的后續(xù)行為障礙〔18〕。有報道稱，miR-34c(p53的直接下游靶標(biāo))可能通過線粒體途徑參與了發(fā)育中的大鼠大腦海馬體中神經(jīng)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔19〕。Zhong等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，Sevo通過靶向MyD88，上調(diào)miR-203表達(dá)，減輕I/R引起的神經(jīng)炎癥。本研究結(jié)果表明，Sevo預(yù)處理通過下調(diào)miR-148b-3p表達(dá)來減弱I/R。

DUSP1可在多種組織中表達(dá)，在心臟，肺和肝臟中可觀察到最高水平〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)，DUSP1通過失活JNK-Mff途徑和抑制線粒體裂變來減輕腦缺血再灌注損傷〔22〕。本研究結(jié)果表明，Sevo預(yù)處理通過靶向miR-148b-3p促進(jìn)DUSP1在體外I/R模型中的表達(dá)。