◎ 劉 瑩，倪春苗，李思佳，徐映如

（上海市虹口區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200082）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是革蘭氏染色陰性、有鞭毛、無(wú)芽孢和莢膜的條件致病菌，在海洋和河口中分布廣泛，不僅對(duì)魚(yú)、蝦、貝類(lèi)等水生生物具有致病性，還能通過(guò)進(jìn)食被感染的水產(chǎn)品和感染創(chuàng)口等方式引起人體食物中毒、組織壞死、中耳炎等疾病[1]。因此，能快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)溶藻弧菌，有助于及時(shí)阻斷疾病傳播，減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)損失，維護(hù)食品安全和人類(lèi)健康。

1 傳統(tǒng)細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)

通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)分離病原菌，并根據(jù)菌落特征、生化反應(yīng)等方法對(duì)病原菌加以鑒定是食源性病原菌的經(jīng)典檢測(cè)手段[2]。張曉艷等[3]先使用3%氯化鈉堿性蛋白胨水對(duì)樣本進(jìn)行增菌，再依次接種到TCBS平板和科瑪嘉弧菌顯色平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后通過(guò)生化反應(yīng)鑒定目標(biāo)菌落。溶藻弧菌在TCBS平板上為圓形、表面光滑、大而扁平的黃色菌落，在科瑪嘉平板上為較小的無(wú)色菌落。傳統(tǒng)細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)在檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用廣泛，但完成一次檢測(cè)通常需要數(shù)天，不適用于大樣本量或緊急情況的檢測(cè)。

2 免疫學(xué)技術(shù)

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種十分靈敏的免疫學(xué)檢測(cè)方法，原理是抗原與抗體的特異性結(jié)合，以及作為標(biāo)記物的酶與底物發(fā)生的顯色反應(yīng)，既可以通過(guò)觀察有無(wú)顯色反應(yīng)來(lái)做定性判斷，也可以利用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度進(jìn)行定量分析[4]。李明云等[5]構(gòu)建了表達(dá)溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的重組質(zhì)粒pET-28a-OmpK，利用該蛋白免疫小鼠得到抗血清，建立溶藻弧菌間接ELISA檢測(cè)法，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度為104CFU·mL-1。職通瑞等[6]以滅活溶藻弧菌為抗原制備兔抗溶藻弧菌抗體，建立了間接ELISA檢測(cè)法，靈敏度為104CFU·mL-1，與副溶血性弧菌等6種弧菌無(wú)交叉反應(yīng)。

2.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法（Colloidal Gold Immunochromatography Assy，GICA）通過(guò)觀察待檢物質(zhì)與膠體金標(biāo)記的抗原或抗體在膜上相結(jié)合發(fā)生的顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)病原菌，較ELISA更快速簡(jiǎn)便，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及疾病初篩[7]。王蓓等[8]利用兔抗溶藻弧菌多克隆抗體制作了穩(wěn)定性良好的溶藻弧菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙，檢測(cè)靈敏度為106CFU·mL-1，檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)10 min，與其他8株菌無(wú)交叉反應(yīng)。李嘉文等[9]通過(guò)待檢細(xì)菌樣品與溶藻弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物、全菌破碎蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合膠體金標(biāo)記的兔抗溶藻弧菌多克隆抗體來(lái)檢測(cè)溶藻弧菌，方法靈敏度為5×105CFU·mL-1，反應(yīng)時(shí)間為10～15 min，與副溶血性弧菌等4種弧菌無(wú)交叉反應(yīng)。

2.3 免疫磁珠分離法

免疫磁珠分離法（Immunomagnetic Beads Separation，IMBS）利用包被特異性抗體的免疫磁珠與目標(biāo)抗原相結(jié)合，在磁場(chǎng)的作用下分離抗原，具有簡(jiǎn)易、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[10]。紀(jì)勇[11]以兔抗溶藻弧菌IgG包被的免疫磁珠富集溶藻弧菌，確立了該方法中免疫磁珠的最佳工作濃度和最佳反應(yīng)時(shí)間，靈敏度為 2.8 CFU·mL-1。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）利用DNA半保留復(fù)制和堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，通過(guò)一對(duì)特異性引物體外擴(kuò)增目標(biāo)基因片段，操作簡(jiǎn)單、靈敏快速、特異性強(qiáng)[12]。龐興紅等[13]針對(duì)溶藻弧菌毒力菌株HN08155的SDRH基因設(shè)計(jì)引物，使用該引物可以鑒別與HN08155菌株具有相似遺傳型的溶藻弧菌毒力菌株，該方法靈敏度為1.58×102CFU·mL-1。李丹丹等[14]設(shè)計(jì)了雙啟動(dòng)寡核苷酸引物來(lái)檢測(cè)溶藻弧菌的膠原蛋白水解酶基因，雙啟動(dòng)寡核苷酸引物比普通引物特異性更強(qiáng)，退火溫度范圍更大，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度為1.14×102CFU·mL-1。

3.2 多重PCR

多重PCR（Multiplex PCR，MPCR）是指在一個(gè)PCR反應(yīng)管中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶基因序列，因此比普通PCR的檢測(cè)效率更高[15]。桑艷嬌等[16]針對(duì)副溶血性弧菌和溶藻弧菌的gyrB基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了靈敏度高、特異性強(qiáng)的可同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌和溶藻弧菌的檢測(cè)方法，其中檢測(cè)溶藻弧菌的靈敏度為2.03×102CFU·mL-1。魏霜等[17]設(shè)計(jì)了5對(duì)引物——4對(duì)包括溶藻弧菌gyrB基因在內(nèi)的食源性弧菌基因引物和1對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因引物，建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)4種食源性弧菌并能排除假陰性的五重PCR檢測(cè)法，對(duì)溶藻弧菌的檢測(cè)靈敏度為10 CFU·mL-1。

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)隨PCR反應(yīng)而積累，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)得到擴(kuò)增曲線(xiàn)和CT值，從而進(jìn)行基因定量檢測(cè)，該方法用時(shí)短、自動(dòng)化高、靈敏度高、特異性強(qiáng)[18]。李丹丹等[19]針對(duì)溶藻弧菌膠原蛋白水解酶基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，構(gòu)建了一種特異性良好的溶藻弧菌qPCR檢測(cè)法，靈敏度為18 CFU·mL-1。鐘淵福等[20]針對(duì)溶藻弧菌鞭毛基因fli C設(shè)計(jì)探針引物，建立了Taqman探針qPCR檢測(cè)法，靈敏度為102CFU·mL-1，特異性良好。

3.4 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是第三代核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)微滴化處理將核酸樣品平均分配到幾十到幾十萬(wàn)個(gè)反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后根據(jù)熒光信號(hào)陽(yáng)性數(shù)和泊松分布對(duì)DNA拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量[21]。李丹等[22]利用優(yōu)化的微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系檢測(cè)溶藻弧菌，結(jié)果顯示其準(zhǔn)確度與靈敏度均優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，說(shuō)明該方法在低濃度DNA檢測(cè)中存在優(yōu)勢(shì)。

3.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）核酸擴(kuò)增在恒溫下進(jìn)行，不需要昂貴的儀器設(shè)備，較普通PCR和qPCR更便捷、快速、經(jīng)濟(jì)，該法的關(guān)鍵是LAMP引物的設(shè)計(jì)[23]。徐義剛等[24]針對(duì)溶藻弧菌膠原酶基因設(shè)計(jì)LAMP引物，65 ℃下反應(yīng)45～60 min即可成功擴(kuò)增出典型LAPM條帶，用該方法檢測(cè)純培養(yǎng)溶藻弧菌和污染水產(chǎn)品中溶藻弧菌，靈敏度分別為 10 CFU·mL-1和 19 CFU·mL-1。陳昌國(guó)等[25]針對(duì)溶藻弧菌gyrB基因設(shè)計(jì)LAMP引物，結(jié)果顯示最佳擴(kuò)增溫度和時(shí)間分別為60 ℃和60 min，該方法靈敏度為 10-4mg·L-1。

4 其他溶藻弧菌檢測(cè)技術(shù)

4.1 PCR-變性高效液相色譜法

PCR-變性高效液相色譜法（PCR-Denaturing High Performance Liquid Chromatography，PCRDHPLC）指利用變性高效液相色譜法檢測(cè)靶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后根據(jù)樣本中不同菌株的特異性峰型來(lái)判定目標(biāo)菌株，與傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物鑒定法——凝膠電泳法相比，可實(shí)現(xiàn)更快速、高通量的檢測(cè)[26]。邵碧英等[27]在單一PCR的基礎(chǔ)上建立了多重PCR-變性高效液相色譜法（MPCR-DHPLC），可以同時(shí)檢測(cè)5種食品中的致病性弧菌——霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和擬態(tài)弧菌。

4.2 生物芯片

生物芯片（Biochip）可以通過(guò)收集芯片載體上的生物分子探針與被標(biāo)記的靶分子的雜交信號(hào)來(lái)檢測(cè)病原微生物，生物分子探針有寡核苷酸、抗原、抗體等，該法具有高通量、高靈敏度、高特異性的優(yōu)點(diǎn)[28]。丁君等[29]構(gòu)建了一種可以同時(shí)檢測(cè)溶藻弧菌、副溶血性弧菌等6種致病性弧菌的基因芯片。繩秀珍等[30]用6種常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)病原性弧菌的外膜蛋白、胞外產(chǎn)物、鞭毛蛋白和全菌蛋白構(gòu)建了血清學(xué)診斷抗原芯片。

4.3 生物傳感器

生物傳感器（Biosensor）的原理是將生物物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)化成電信號(hào)加以檢測(cè)，高效、快速、靈敏，廣泛應(yīng)用于食品檢驗(yàn)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[31]。TIAN等[32]利用石墨烯開(kāi)發(fā)了一種基于溶藻弧菌特異性DNA酶的熒光傳感器，反應(yīng)快速，靈敏度高，特異性強(qiáng)。

4.4 核酸適配體

核酸適配體（Aptamer）是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出來(lái)的與靶基因具有高特異性和親和力的單鏈寡核苷酸序列[33]。林筱鈞等[34]構(gòu)建了磁珠-核酸適配體-熒光報(bào)告探針復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)中的熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)溶藻弧菌的定量檢測(cè)。

4.5 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometer，MALDI-TOF MS）將通過(guò)軟電離獲得的細(xì)菌蛋白質(zhì)組特異性指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)來(lái)鑒定目標(biāo)菌種[35]。趙曉娟等[36]建立了溶藻弧菌MALDI-TOF MS檢測(cè)法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)中的影響因素進(jìn)行比較評(píng)估，發(fā)現(xiàn)傳代次數(shù)不影響檢測(cè)結(jié)果，而甲酸提取法、合適的激光強(qiáng)度和完備的數(shù)據(jù)庫(kù)可提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。

5 結(jié)語(yǔ)

溶藻弧菌作為海洋和水生生物中常見(jiàn)的條件致病菌，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品安全和人類(lèi)健康都存在著潛在威脅。因此，溶藻弧菌也被列為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)常規(guī)監(jiān)測(cè)菌種之一。隨著對(duì)溶藻弧菌生物學(xué)特性的深入研究，新型檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備的不斷出現(xiàn)，以及各種檢測(cè)技術(shù)的相互結(jié)合，將來(lái)會(huì)有更多更快速、靈敏、精確、高通量的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到溶藻弧菌的檢測(cè)中去。