巫瑤 于洋 朱玲 王霞 萬莉紅

·綜述·

外泌體作為藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展#

巫瑤*1于洋2朱玲1王霞3△萬莉紅1△

（1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610041；3. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041）

外泌體是一種由細(xì)胞分泌的直徑約40-100 nm的盤狀囊泡，具有天然脂質(zhì)雙分子層，其內(nèi)包含了復(fù)雜的RNA和蛋白質(zhì)。大多數(shù)細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均能產(chǎn)生外泌體，這些外泌體主要存在于體液中，在細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸和信號交流中發(fā)揮著重要作用。作為天然內(nèi)源性納米級載體，外泌體具有毒性小、穩(wěn)定性好、、滲透性好、靶向歸巢性強(qiáng)、能透過血腦屏障、可包載的物質(zhì)種類多等特點(diǎn)，故可能成為具有良好應(yīng)用前景的藥物遞送載體。本文主要介紹外泌體的基本性質(zhì)、制備、載藥方式，并歸納了其作為藥物遞送載體的研究進(jìn)展。

外泌體；藥物遞送系統(tǒng)；天然內(nèi)源性納米級載體；靶向

目前已經(jīng)有很多新型納米材料被開發(fā)應(yīng)用于治療多種重大疾病[1, 2]。相比于傳統(tǒng)藥物遞送載體，納米材料尺寸小、材料和形狀特殊，可在一定程度上提高療效[3]。

但是，大部分納米載體不能被降解，易于堆積、自由移動(dòng)，從而阻塞微循環(huán)造成細(xì)胞持久性損傷，因此存在潛在的安全性問題[4]。而外泌體是生物體在正?；蛘卟±頎顟B(tài)下產(chǎn)生的納米級細(xì)胞囊泡，具有與脂質(zhì)體相似的膜狀結(jié)構(gòu)，這促使研究者們開始思考能否將藥物裝載到脂質(zhì)體中的經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用于外泌體中。此外，外泌體還具有體積小、可荷電、能被修飾具有靶向性、逃避吞噬、能透過血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)[5]。因此，外泌體作為天然內(nèi)源性納米載體，具有良好應(yīng)用前景，可被開發(fā)用于藥物的遞送。

1 外泌體概況

1.1 來源

外泌體可被免疫細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生[6]，可在血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁、羊水、腹水和膽汁等多種體液中出現(xiàn)[7-11]。

1.2 特性

作為細(xì)胞分泌產(chǎn)物的外泌體具有一定的內(nèi)在靶向性，如中樞神經(jīng)細(xì)胞分泌的外泌體能透過血腦屏障，靶向特定的神經(jīng)元[12]；缺氧腫瘤細(xì)胞來源的外泌體傾向于向缺氧腫瘤組織內(nèi)聚集[13]。另外，通過設(shè)計(jì)外泌體膜表面與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體、配體或受體可實(shí)現(xiàn)外泌體外源靶向性。

外泌體主要有兩種不同類型的靶向修飾[14-16]。一種是通過基因工程技術(shù)在外泌體膜上表達(dá)靶向多肽，從而使外泌體具有靶向功能[17]。另外一種是在外泌體膜表面直接進(jìn)行修飾，如受體蛋白工程[18]。

1.3 外泌體作為藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用

外泌體可用于包載小分子藥物，使藥物在靶細(xì)胞內(nèi)富集，增加小分子藥物的穩(wěn)定性并延長其血液循環(huán)時(shí)間，進(jìn)而提高藥物的療效。

已有研究顯示，一些小分子化療藥物可以被包載于外泌體中從而達(dá)到治療疾病的作用，如紫杉醇[19]、姜黃素[20]、多柔比星[21]等。除小分子外，外泌體還可用于包載大分子，如蛋白質(zhì)藥物和基因藥物等。

2 外泌體的制備

目前大規(guī)模生產(chǎn)外泌體的方法主要是自發(fā)生產(chǎn)和非自發(fā)生產(chǎn)兩種方式。自發(fā)生產(chǎn)通過依賴中空纖維生物反應(yīng)器為細(xì)胞生長提供高表面積比，進(jìn)而支持高密度的細(xì)胞自發(fā)釋放外泌體[22]。研究表明，自發(fā)生產(chǎn)方式耗時(shí)長，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。

非自發(fā)生產(chǎn)方式主要通過增加外部刺激條件來觸發(fā)細(xì)胞釋放大量外泌體，非自發(fā)生產(chǎn)方式可分為三類：生物刺激、化學(xué)刺激、物理刺激，異同點(diǎn)見表1。

2.1 提取與分離

由于外泌體的形態(tài)與其他細(xì)胞外小體相似，大小范圍重疊，且體積過小，使得外泌體的分離變得非常困難[23-26]。不同的分離方法所得的外泌體產(chǎn)量不同、操作不同、耗時(shí)不同、價(jià)格也不同，異同點(diǎn)見表2。其中，超速離心法常常作為外泌體提取分離的金標(biāo)準(zhǔn)[27]。

2.2 鑒定

外泌體的表征包括了粒徑大小范圍、表面電荷、結(jié)構(gòu)和表面蛋白等，其對外泌體的性質(zhì)和生物學(xué)功能非常重要，并可以影響藥物的裝載和輸送。外泌體的鑒定主要就是對其表征的鑒定[23]。隨著微流控檢測技術(shù)的快速發(fā)展，我們可以實(shí)現(xiàn)高通量、高精度和低試劑消耗的新型外泌體檢測技術(shù)，包括熒光相關(guān)顯微鏡（Fluorescence correlation microscopy，F(xiàn)CM）、比色法檢測、表面等離子體共振（Surface plasmon resonance detection，SPR）檢測和核磁共振（Nuclear magnetic resonance detection，NMR）檢測等[23]。

此外，可以通過評估外泌體的聚散指數(shù)（Polymer dispersity index，PDI）和囊泡的zeta電位，以確定外泌體作為藥物輸送系統(tǒng)的適用性[28]。

而外泌體的濃度，則可以通過測定總蛋白質(zhì)含量來確定。外泌體的RNA含量則可以通過毛細(xì)管電泳、分光光度法和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）來測定。

表1 外泌體非自發(fā)生產(chǎn)方式

刺激方式具體方法優(yōu)勢劣勢 生物刺激血清饑餓處理、缺氧處理、細(xì)胞因子處理（如腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素8IL-8、白細(xì)三烯B4 LTB4）快速、成本低、操作簡單、可大規(guī)模生產(chǎn)殘留大量生物活性劑、需要純化、回收率低 化學(xué)刺激細(xì)胞松弛素B抑制肌動(dòng)蛋白的聚合從而促進(jìn)外泌體的釋放、耗時(shí)短、操作簡單需要純化、回收率低 物理刺激物理和機(jī)械力不需要加入刺激因子耗時(shí)、產(chǎn)率不高

表2 外泌體分離方法

方法分離原理優(yōu)勢劣勢 超速離心沉降系數(shù)可大規(guī)模生產(chǎn)、分離純度高時(shí)間長(>4小時(shí))、回收率低(5-25%)、重復(fù)性差 超濾大小和分子量操作簡單、快速回收率低、易損壞、變形 分子尺寸排阻色譜凝膠的孔徑和外泌體的大小高純度和高產(chǎn)量昂貴、色譜柱易污染、分離后分析費(fèi)時(shí)費(fèi)力 沉降試劑盒疏水性樣品量小、操作簡單特異性低、成本高 免疫學(xué)分離抗原-抗體反應(yīng)省時(shí)、高純度、程序簡單昂貴、不能大規(guī)模生產(chǎn) 電泳（DEP）分離大小和電荷快速、高產(chǎn)量低分辨率、低純度 微流控芯片大小快速、成本低、便攜、回收率高、工藝要求高、不能大規(guī)模生產(chǎn)

3 外泌體載藥系統(tǒng)

3.1 載藥方式

外泌體由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成。藥物主要有兩種包載方式：主動(dòng)包載和被動(dòng)包載。不同方法所得外泌體質(zhì)量不同，其藥物裝載率及穩(wěn)定性都不相同。

3.1.1 被動(dòng)包載

被動(dòng)包載的方法總體上比較簡單，主要分為以下兩種。一種是直接將外泌體與藥物進(jìn)行混合后共孵育，藥物會順著濃度梯度進(jìn)入外泌體中，裝載率與藥物的極性大小相關(guān)，但這種方法載藥效率低[20]。另一種是將藥物與外泌體供體細(xì)胞混合后共孵育，通過這些細(xì)胞胞吞藥物后再分泌出裝載了藥物的外泌體[29]。這種方法的載藥效率也不高[30, 31]，主要應(yīng)用于包載細(xì)胞毒性較低且脂溶性較高的小分子化學(xué)藥物[32]。

3.1.2 主動(dòng)包載

主動(dòng)包載相較于被動(dòng)包載，其藥物包載率更高。大分子的裝載常通過主動(dòng)包載這種方式被包載。主動(dòng)包載主要包括超聲法、擠出法、反復(fù)凍融法、電致孔法，其中超聲法和擠壓法會破壞膜的完整性[33, 34]，異同點(diǎn)見表3。

3.2 影響載藥率的因素

3.2.1 外泌體/藥物比例

大多數(shù)研究傾向于使用較多的外泌體，該比例的選擇與藥物的特性有關(guān)。疏水性藥物應(yīng)先溶解于有機(jī)溶劑如醇類溶劑中，稀釋后再與外泌體溶液混合。而親水性藥物可預(yù)先溶解于生物相容的親水性溶劑中，再直接與外泌體溶液混合[28]。

3.2.2 外泌體細(xì)胞來源

不同細(xì)胞來源的外泌體其表面具有不同的標(biāo)記蛋白[35]。而牛奶來源的外泌體價(jià)格低廉，可用于大規(guī)模生產(chǎn)，常被用于天然化合物和化療化合物的藥物輸送[36]，具有良好的前景[37-39]。

表3 外泌體主動(dòng)包載方法

方法具體操作優(yōu)勢劣勢 超聲法均質(zhì)探頭超聲包載率高外泌體聚集、表面蛋白結(jié)構(gòu)改變 擠出法通過具有多孔膜的脂質(zhì)擠出機(jī)擠出載藥效率高、粒徑均一改變外泌體膜的性質(zhì) 反復(fù)凍融法混合物依次在室溫、液氮條件下共孵育，再解凍操作簡單、條件溫和、可大規(guī)模生產(chǎn)外泌體的聚集、包載率低 電致孔法利用電場在外泌體膜上打孔操作簡單RNA 沉淀、外泌體聚集

3.2.3 藥物性質(zhì)

外泌體的結(jié)構(gòu)是基于天然的膦脂雙層膜，具有親脂性，而親脂性藥物可以很好地融入到雙層結(jié)構(gòu)中，不容易從膜上釋放，從而具有持續(xù)釋放藥物的特性。根據(jù)藥物的相對親水性/疏水性，應(yīng)慎重選擇和優(yōu)化合適的裝載方法[28]。

4 總結(jié)與展望

本文主要介紹了外泌體的基本性質(zhì)、制備、載藥方式，并歸納了其作為藥物遞送載體的研究進(jìn)展。

盡管外泌體作為藥物載體具有生物兼容性、穩(wěn)定性、內(nèi)在靶向性等潛在優(yōu)勢，但其作為藥物遞送系統(tǒng)的研究仍然不夠深入，還有很多問題有待解決，外泌體作為藥物載體從實(shí)驗(yàn)室到市場有很長一段路要走，需要研究者的共同努力。

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（2022-04-01）

四川省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號：2020YFS0103）；

巫瑤，女，四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室研究生，Email：1274795088@qq.com；

王霞，女，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作，Email：80832491@qq.com；

萬莉紅，女，教授，主要從事藥理學(xué)教學(xué)與科研工作，Email：wanlihong1976@sina.com。