段春艷 ，高凌云，2△

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610054；2.四川省人民醫(yī)院·四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院東院，四川 成都 610101)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease, ILD)中最常見的一種疾病，占所有ILD病例的17%～86%[1]。目前臨床治療IPF的方案包括抗纖維化藥物、糖皮質(zhì)激素、肺移植等[2]，這些方案治療效果并不明顯，還可能帶來嚴(yán)重的副作用。當(dāng)前IPF患者的生活質(zhì)量低下，亟待安全、有效、方便的治療藥物來改善IPF患者的預(yù)后。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的多功能性及其調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥和促進(jìn)上皮組織修復(fù)的能力促使MSCs快速在IPF治療中的應(yīng)用。本文綜述了IPF的流行病學(xué)及發(fā)病機(jī)制、MSCs體外移植治療IPF的臨床前研究和已知結(jié)果的臨床研究，并分析提高M(jìn)SCs治療效率策略，以指導(dǎo)設(shè)計未來的臨床研究，來治療這一病因復(fù)雜的疾病。

1 IPF的流行病學(xué)及發(fā)病機(jī)制

IPF是一種與肺組織結(jié)構(gòu)重塑和成纖維細(xì)胞過度沉積有關(guān)的慢性肺部疾病，具體發(fā)病機(jī)制至今不明。據(jù)統(tǒng)計，1998～2010年，在英國因肺纖維化住院的患者以大約每年5%的速度在增長，平均發(fā)病年齡為66～71歲，老年男性最為多見[3]。IPF全球發(fā)病率為(0.09～1.30)/10萬，流行率為(0.33～4.51)/10萬[4]。IPF的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，全球IPF患者約500萬人，患者診斷IPF后，如果不經(jīng)治療，平均預(yù)期壽命不超過5年，死亡率超過了許多惡性腫瘤[1]。

雖然IPF機(jī)制尚未闡明，但已有的研究對其病因的理解是在損傷等病理環(huán)境中肺泡上皮細(xì)胞反復(fù)損傷后致肺間質(zhì)細(xì)胞成分的改變。肺泡上皮細(xì)胞功能障礙被認(rèn)為是IPF 發(fā)病的關(guān)鍵步驟，IPF上皮細(xì)胞損傷后的異常修復(fù)反應(yīng)是疾病發(fā)生的一個重要機(jī)制。肺纖維化發(fā)病的關(guān)鍵步驟是肺泡上皮細(xì)胞損傷后無法執(zhí)行自身的修復(fù)功能障礙，進(jìn)而分泌大量的促炎因子及致纖維化細(xì)胞因子造成間質(zhì)中成纖維細(xì)胞增殖活化、巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)改變，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，形成支持纖維形成的正反饋環(huán)，不斷促進(jìn)纖維細(xì)胞灶的形成和細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過多沉積以及異常上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelail-mesenchymal transition, EMT)和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞、持續(xù)的組織重塑與永久性纖維瘢痕的形成[5]。

2 MSCs治療肺纖維化現(xiàn)狀

2.1 MSCs體外移植治療肺纖維化臨床前研究現(xiàn)狀近年來，以干細(xì)胞治療為核心的再生醫(yī)學(xué)技術(shù)，尤其是MSCs，為人類難治性疾病的治療帶來了希望，同時也為MSCs移植治療IPF提供了新的思路。MSCs可以從許多組織來源進(jìn)行分離和鑒定出來，包括骨髓、臍帶、脂肪組織及胎盤等。1995年，Haynesworth等[6]首次將MSCs作為細(xì)胞藥物制劑進(jìn)行臨床應(yīng)用。2003年，Ortiz等[7]首次發(fā)現(xiàn)MSCs可顯著減輕小鼠肺纖維化。

大多數(shù)肺纖維化的動物模型中[8～10]，外源性MSCs移植治療已經(jīng)達(dá)到了預(yù)期的效果。 MSCs可減少肺組織炎癥反應(yīng)、膠原蛋白沉積和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、降低了支氣管肺泡灌洗液中炎癥標(biāo)志物、改善Ashcroft評分，提高了存活率，對急性肺纖維化有很大的治療效果。當(dāng)肺組織受損時，MSCs可被激活并被召集到受傷的肺組織，通過分泌生物活性分子和調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)，減輕局部炎癥反應(yīng)，抑制纖維增殖，增強(qiáng)內(nèi)源性肺損傷抵抗力，從而建立了一個促進(jìn)肺泡上皮再生的微環(huán)境。

以往關(guān)于MSCs可能治療肺纖維化的機(jī)制為：當(dāng)肺組織存在損傷時，MSCs可歸巢至博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷區(qū)域[7],在可溶性介質(zhì)中的趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與細(xì)胞膜表面的同源受體CXCR4的相互作用下，MSCs遷移到損傷和炎癥部位[11]，并通過典型Wnt通路(糖原合成酶激酶3β和β-連環(huán)蛋白)和非典型 Wnt 通路(c-Jun氨基末端激酶和蛋白激酶C)分化為II型肺泡上皮細(xì)胞，發(fā)揮修復(fù)受損的細(xì)胞以減輕肺纖維化[12]。但新近學(xué)者通過命運(yùn)追蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MSCs的歸巢很少見，并未通過向肺泡上皮細(xì)胞分化達(dá)到抗纖維化作用[13]。那MSCs究竟是如何發(fā)揮抗纖維化的作用呢？近年來，在體內(nèi)外實驗的研究種發(fā)現(xiàn)MSCs衍生的分泌組才是MSCs真正發(fā)揮抗纖維化的重要組成部分。MSCs來源的分泌物主要由可溶性蛋白、細(xì)胞外囊泡和細(xì)胞器構(gòu)成，而研究最多的是細(xì)胞外囊泡其中的一個亞型-外泌體。外泌體是MSCs在靜息或缺氧應(yīng)激、凋亡、剪切力等因素刺激下分泌產(chǎn)生的小圓形膜片，直徑在50～100 nm，包含mRNA、 miRNA 以及線粒體等，是促進(jìn)細(xì)胞間信息交流的重要機(jī)制，具有明確的組織再生修復(fù)作用以及潛在的免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞生長分化等功能，是干細(xì)胞領(lǐng)域具有重要研究價值的新興熱點。外泌體可通過激活轉(zhuǎn)化生長因子信號通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路來調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，調(diào)控單核細(xì)胞表型[14]，修復(fù)受損的上皮細(xì)胞與抑制肌成纖維細(xì)胞達(dá)到逆轉(zhuǎn)肺纖維化的作用[15]。

其它關(guān)于MSCs治療肺纖維化的可能的機(jī)制如下：①抗氧化應(yīng)激：MSCs能有效降低博萊霉素致肺損傷后炎性氧自由基水平，改善超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等氧化損傷指標(biāo)，對肺組織具有保護(hù)作用[16]；②抗炎：MSCs主要是通過激活細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子刺激基因6抑制核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物向細(xì)胞核的激活和轉(zhuǎn)運(yùn)，減少促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α、白介素-1、干擾素γ和白細(xì)胞介素-6的分泌[17]；前列腺素E2與巨噬細(xì)胞上的前列腺素E2受體和前列腺素E4受體結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抗炎性細(xì)胞因子白介素-10的表達(dá)。③免疫調(diào)節(jié)：MSCs降低巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞CD80共刺激分子的表達(dá)和密度，降低其誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力； 通過Fas/FasL信號通路直接誘導(dǎo)活化T細(xì)胞凋亡，緩解異常過度免疫反應(yīng)[18]；MSCs通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化和減少來自巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的趨化因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，進(jìn)一步減少炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的含量[19]，減少B細(xì)胞的募集，維持肺部免疫平衡；④抑制EMT：MSCs可通過改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬作用，從而抑制EMT[20]；⑤減少促纖維介質(zhì)的產(chǎn)生：降低促纖維化因子 Co11a1和 Co13a1的表達(dá)，達(dá)到減少肺纖維化進(jìn)程的目的；抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β/SMAD-3信號通路的激活，從而抑制肌成纖維細(xì)胞的激活，進(jìn)一步減少膠原等ECM的合成[21]；調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶/組織金屬蛋白酶抑制劑的比例來直接抵消纖維化過程[22]，從而減少膠原纖維的含量并抑制肺重塑；可通過增加巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬肽酶-9的表達(dá)以降解膠原蛋白。⑥旁分泌作用：MSCs通過分泌多種生長因子、趨化因子和受體實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能，這些生物活性分子調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)，重構(gòu)了肺微環(huán)境，并抑制炎癥和修復(fù)受損組織[23]。

大部分臨床前研究探討的是早期炎癥階段而不是纖維化晚期。研究發(fā)現(xiàn)，初始炎癥期或纖維化早期注射MSCs后，可減少纖維化形成；而在慢性纖維化期注射MSCs后，可能加重纖維化，這可能與MSCs也能分泌轉(zhuǎn)化生長因子β有關(guān)[24]。然而，Liu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，分泌較高水平轉(zhuǎn)化生長因子-β的MSCs對博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化卻具有抗纖維化作用。

2.2 MSCs治療臨床研究現(xiàn)狀臨床前動物實驗的數(shù)據(jù)結(jié)果令人興奮，但將MSCs用于開展肺纖維化患者臨床試驗，比較擔(dān)心MSCs安全性及有效性問題；擔(dān)心MSCs會進(jìn)一步加重肺纖維化的形成，而無逆轉(zhuǎn)肺纖維化的作用；擔(dān)心移植MSCs后腫瘤形成的可能性。

基于上述擔(dān)心，這些問題已經(jīng)在幾個已經(jīng)完成的臨床試驗中得到評估。全球范圍開展的干細(xì)胞治療肺纖維化臨床試驗多集中在I/II期，目前暫無上市獲批產(chǎn)品。一項在澳大利亞進(jìn)行的Ib期單中心非隨機(jī)研究(NCT01385644)[26]，探討靜脈輸注異體胎盤MSCs對IPF患者的治療潛力，用1×106/kg、2×106/kg的MSCs分別治療了4例中重度IPF患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者對這兩種劑量的干細(xì)胞都耐受，只有輕微和一過性急性不良反應(yīng)，但是隨訪6個月后，各項監(jiān)測指標(biāo)(包括用力肺活量、一氧化碳彌散量、6分鐘步行試驗和CT纖維化評分)均較基線無改變，并沒有減輕肺纖維化。在另一個的Ⅰ期臨床試驗(NCT02013700)中[27]，將9例輕中度IPF患者分成3組，每組分別靜脈輸注20×106、100×106、200 ×106個骨髓MSCs，評估了單次靜脈輸注骨髓MSCs治療IPF的安全性問題。隨訪期間，沒有發(fā)生與治療相關(guān)及急性嚴(yán)重不良事件，僅2例因IPF的進(jìn)展而非與治療相關(guān)的死亡發(fā)生，共有21例不良反應(yīng)報告(最常見的不良記錄是3例支氣管炎和2例普通感冒)，在輸注60周后，F(xiàn)VC預(yù)測值的平均下降率為3.0%，一氧化碳彌散量預(yù)測值下降率為5.4%。2020年發(fā)表在《干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》上的一項研究[28]首次揭示了對于肺功能迅速下降的IPF患者來說，高累積劑量的同種異體 MSCs(共計1.6×109個/例)治療是安全和可耐受的，經(jīng)治療52周后接受MSCs組臨床癥狀顯著改善，無嚴(yán)重不良反應(yīng)，但該臨床試驗發(fā)現(xiàn)試驗組與對照組之間死亡率及高分辨率 X射線計算機(jī)斷層成像纖維化評分無差異。一項隨訪時間長達(dá)60月關(guān)于IPF患者細(xì)胞治療的縱向結(jié)果的研究[29]，該報告指出IPF患者接受支氣管內(nèi)輸注脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞過程中，未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，但患者距離第一次給藥2年后出現(xiàn)肺功能下降，患者總體生存率及疾病進(jìn)展時間與已經(jīng)發(fā)表的未經(jīng)治療IPF人群的流行病學(xué)以及與吡非尼酮和尼達(dá)尼布的大型III期隨機(jī)對照試驗的安慰劑組相似。一項I期多中心IPF支氣管內(nèi)自體骨髓MSCs臨床試驗(NCT01919827)發(fā)現(xiàn)3例患者的MSCs在培養(yǎng)后,檢測到染色體畸變，MSCs的基因組不穩(wěn)定可能會給IPF患者使用自體骨髓MSCs帶來麻煩[30]。

目前尚未報道MSCs治療肺纖維化相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)和與治療相關(guān)腫瘤形成，但由于動物和人類的差異以及臨床試驗樣本量小，該藥物在人體中的安全性和有效性仍然值得懷疑和高度重視，需開展多中心的隨機(jī)對照臨床試驗來證明 MSCs 治療IPF患者的安全性及療效。

3 提高M(jìn)SCs治療效率策略

第一代基于原代干細(xì)胞(如MSCs及其衍生物)的療法，在過去數(shù)十年里，已被廣泛應(yīng)用于各種復(fù)雜性的疾病。然而MSCs治療效果并未滿足臨床試驗的要求，并且將MSCs成功運(yùn)用于臨床需要克服許多挑戰(zhàn)，因此如何增強(qiáng)MSCs的功效以適應(yīng)宿主微環(huán)境成為當(dāng)務(wù)之急。直到最近幾年，第二代基于干細(xì)胞的療法-細(xì)胞工程技術(shù)的出現(xiàn)，才極大的擴(kuò)展了MSCs治療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍并提高了MSCs的特異性及有效性。干細(xì)胞工程是通過體外培養(yǎng)MSCs、誘導(dǎo)MSCs定向分化、利用基因編輯技術(shù)(如成簇而規(guī)律地間隔短回文重復(fù)序列-Cas系統(tǒng))對MSCs進(jìn)行遺傳修飾，使改造后的MSCs具有增強(qiáng)的歸巢、效價或擴(kuò)增能力。一項研究發(fā)現(xiàn)成簇而規(guī)律地間隔短回文重復(fù)序列-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的可逆永生化小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有MSCs的多功能特性[31]，這種工程化的MSCs可以作為原代MSCs的一個具有重要前景的替代來源，用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究。此外還包括以下幾種策略：①通過小分子、缺氧或生物材料對結(jié)構(gòu)的刺激來啟動MSCs，以細(xì)胞因子、生長因子、缺氧、藥物、不同的生物材料、不同的培養(yǎng)條件以及其他不同的分子進(jìn)行預(yù)處理，提高M(jìn)SCs的存活增殖、遷移能力、免疫調(diào)節(jié)以及治療效果[32]；②利用MSCs分泌組作為藥物輸送平臺進(jìn)行靶向治療[33]，未來將MSCs分泌組作為無細(xì)胞藥物靶向定位目標(biāo)器官以進(jìn)行治療，將發(fā)揮極大的臨床應(yīng)用價值；③通過提供一種支持MSCs粘附的支架來改善MSCs生存能力和功能的生物材料。未來將有更多提高M(jìn)SCs治療效果的方式，MSCs療效將進(jìn)一步得到證實。

4 MSCs治療肺纖維化當(dāng)前挑戰(zhàn)與展望

在過去幾十年中，MSCs被廣泛運(yùn)用于臨床。雖然各種動物疾病模型的臨床前研究令人欣喜，但是否針對人體的慢性肺纖維化期，仍需要進(jìn)一步探索和研究。將MSCs療法用于多種人類疾病的注冊臨床試驗尚未達(dá)到預(yù)期效果。成功應(yīng)用MSCs治療IPF患者仍需要克服許多挑戰(zhàn)，主要挑戰(zhàn)包括不同來源的MSCs的免疫相容性、穩(wěn)定性、異質(zhì)性、分化和遷移能力以及與宿主微環(huán)境的不一致性。應(yīng)對MSCs治療IPF患者的長期隨訪上,以確定MSCs治療可能的致癌作用和能否逆轉(zhuǎn)肺纖維化以提高IPF患者的生存率。在進(jìn)行大規(guī)模臨床試驗之前，必須考慮影響MSCs在體內(nèi)活性的重要因素，包括干細(xì)胞組織來源及細(xì)胞類型、供體和受體、給藥途徑、輸注方式、劑量和給藥頻率，以及對MSCs的預(yù)處理，確定在哪個階段的IPF患者是最應(yīng)該接受哪種類型MSCs治療以及藥物之間的相互作用，以最大限度提高其治療效果，同時減少潛在的副作用。MSCs有望是逆轉(zhuǎn)肺纖維化的有效治療手段之一。