張 楠，許苗苗，杜赟赟，劉鳳鳳，陳洪衛(wèi)，謝志民*

（1.西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054；2.西安遠大德天藥業(yè)股份有限公司，陜西 西安 710119）

抱莖獐牙菜Swertia franchetianaH. smith是龍膽科獐牙菜屬一年生草本植物，為傳統(tǒng)藏藥藏茵陳基原植物之一，分布于甘肅、青海、四川等地。其性涼、味苦，具疏肝利膽功效[1]，臨床用于治療肝膽類疾病效果顯著[2]?，F(xiàn)代研究表明，其所含有效成分主要為環(huán)烯醚萜類、黃酮類、酮類、三萜類化合物[3-4]。抱莖獐牙菜目前被收錄到青海省地方標(biāo)準(zhǔn)中，質(zhì)控參數(shù)主要為齊墩果酸的薄層色譜鑒別和獐牙菜苦苷的含量測定，文獻研究也大多以單獨或幾個成分的含量測定作為質(zhì)控方法[5-6]，此種采用對照品進行薄層鑒別和針對個別化合物的含量測定方法專屬性差，難以有效控制其質(zhì)量。中藥指紋圖譜作為評價天然藥物或中藥最有效方法之一[7]，從化學(xué)成分的角度整體反映藥材的特性，專屬性強，方法快速簡便?；诖?，本研究以抱莖獐牙菜為研究對象，建立了HPLC指紋圖譜和4種有效成分的含量測定方法，兩者結(jié)合為抱莖獐牙菜的鑒別、質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；BT124S型電子天平（賽多利斯公司）。獐牙菜苦苷（批號：1017116-11180003，純度：8.3%）、芒果苷（批號：110753-201817，純度：98.4%）、龍膽苦苷（批號：110770-201918，純度：99.1%）、當(dāng)藥醇苷（批號：111897-201001，純度＞98%）、齊墩果酸（批號：110709-201808，純度：91.1%）、當(dāng)藥苷（批號：110749-201718，純度：100%）均購于中國食品藥品檢定研究院；異葒草苷（批號：111897-201001，純度＞98%）、異牡荊苷（批號：111897-201001，純度＞98%）購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；當(dāng)藥黃素（批號：190803-084，純度＞98%）購于北京盛世康普化工技術(shù)研究院；甲基當(dāng)藥寧（批號：Z26S10S98826，純度＞98%）購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。10批樣品為課題組于青海、四川等地自采或購于藥材市場，經(jīng)西安市食品藥品檢驗所謝志民主任藥師鑒定為龍膽科獐牙菜屬抱莖獐牙菜Swertia franchetianaH. smith 的干燥全草，新鮮樣品除去泥土等雜質(zhì)，晾干，樣品詳細情況見表1。

表1 樣品來源Tab. 1 Sample sources

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Welch Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為乙腈，B為0.1%的磷酸水溶液，梯 度 洗 脫：0 ～ 30 min，8%A；30 ～ 60 min，8% →17%A； 60 ～ 70 min，17% → 25%A；70 ～ 115 min，25% → 55%A；115 ～ 135 min，55% → 85%A；體積流量：1.0 mL/min，柱溫：30 °C，檢測波長：0 ～ 115 min為240 nm，115 ～ 135 min為205 nm。

2.2 樣品與對照品溶液的制備

2.2.1 樣品溶液的制備 精密稱取樣品中粉約0.20 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率：270 W，頻率：45 kHz）30 min，放冷，用80%甲醇補足失重，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取獐牙菜苦苷、芒果苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、異葒草苷、異牡荊苷、當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、甲基當(dāng)藥寧、齊墩果酸對照品適量，加甲醇制成濃度依次為1 604.0 μg/mL、97.0 μg/mL、81.4 μg/mL、201.6 μg/mL、 40.0 μg/mL、39.9 μg/mL、58.1 μg/mL、68.5 μg/mL、43.8 μg/mL、57.6 μg/mL的溶液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取S1樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD分別小于1.37%和1.85%。6針樣品相似度分析結(jié)果為0.970，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取S1樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，于0、2.5、5、8、12、16、20、24 h，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%。相似度結(jié)果為0.980，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取S1樣品6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間RSD 均小于1.68%，相對峰面積RSD均小于2.5%，相似度結(jié)果為0.985，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立 取10 批樣品，按 “2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，得到10批樣品的色譜圖，再取“2.2.2”項下的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，得到混合對照品色譜圖，結(jié)果見圖1。將10批供試品溶液色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012）”軟件進行分析，以S1樣品圖譜為參照圖譜，對色譜峰進行多點校正后，自動匹配，生成對照指紋圖譜，計算10批樣品和對照指紋圖譜之間的相似度，共標(biāo)定16個共有峰，見圖2。

圖1 混合對照品(A)和抱莖獐牙菜供試品(B)色譜圖Fig. 1 HPLC of mixed reference substance(A) and Swertia franchetiana sample(B)

圖2 10批抱莖獐牙菜藥材疊加指紋圖譜Fig. 2 HPLC standard chromatographic fingerprint for 10 batches of Swertia franchetiana sample

2.4.2 峰的確認 16個共有峰經(jīng)與對照品保留時間和紫外光譜對比，確認了1、2、3、4、5、6、7、10、11、16號峰分別為獐牙菜苦苷、芒果苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、異葒草苷、異牡荊苷、當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、甲基當(dāng)藥寧、齊墩果酸，以5號峰為參照峰（S）。

2.4.3 數(shù)據(jù)分析 以參照峰的保留時間和峰面積作為1，計算共有色譜峰的相對保留時間見表2，相對峰面積見表3，相似度計算結(jié)果分別為0.987、0.984、0.980、0.939、0.880、0.912、0.876、0.990、0.978、0.864。

表2 共有峰相對保留時間Tab. 2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相對峰面積Tab. 3 Relative peak area of common peaks

2.5 化學(xué)計量分析

2.5.1 聚類分析 以10批樣品中16個共有峰的峰面積為變量，用SPSS 22.0軟件進行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)分離距離為10時，10批樣可聚為2類，S1、S2、S8、S9號聚為第一類，其余為第二類。

圖3 聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis diagram

2.5.2 主成分分析 以10批樣品中16個共有峰峰面積作為變量，采用SPSS 22.0軟件進行主成分分析，提取到4個主成分，累積方差貢獻率為94.426%，見表4。載荷矩陣結(jié)果顯示色譜峰4、13對主成分1的貢獻最大；色譜峰1對主成分2的貢獻最大；色譜峰

表4 主成分分析特征值和方差貢獻率Tab. 4 Principal component analysis eigenvalue and variance contribution rate

8、10對主成分3的貢獻最大；色譜峰2對主成分4的貢獻最大。將10批樣品中16個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件繪制主成分分析圖分析組間差異，結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，見圖4。

圖4 PCA得分圖Fig. 4 PCA score chart

2.6 4種有效成分的含量測定

2.6.1 色譜條件 同“2.1”項前30 min色譜條件。

2.6.2 線性關(guān)系考察 取“2.2”項下的混合對照品溶液為線性關(guān)系考察混合對照品溶液⑦ ，再將該溶液用甲醇稀釋至60%、40%、20%、10%、5%、1%濃度依次得到線性關(guān)系考察⑥、⑤、④、③、②、①號對照品溶液。按“2.1”項下條件測定，以進樣量作為橫坐標(biāo)（X），測得的峰面積作為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，結(jié)果見表5。

表5 4 種有效成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab. 5 Results of linear relationship among 4 active components

2.6.3 精密度試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，獐牙菜苦苷、芒果苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷4種有效成分峰面積的RSD分別為0.25%、0.38%、0.29%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗 同“2.3.3”項下方法，4種有效成分峰面積的RSD分別為0.82%、0.36%、0.92%、1.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 同“2.3.2”項下方法，4種有效成分24 h峰面積的RSD分別為0.48%、0.82%、0.49%、0.56%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗 取已測定各成分含量的樣品（S1）粉末6份，每份0.1 g，按已知含量的100%分別精密加入各成分濃度為獐牙菜苦苷4.241 mg/mL、芒果苷0.154 mg/mL、龍膽苦苷0.157 mg/mL、當(dāng)藥苷0.484 mg/mL的混合對照品溶液2 mL，待溶劑揮發(fā)后按照“2.3”項下方法制成供試品溶液，依法進樣測定各成分含量，結(jié)果所測4個成分的平均加樣回收率（RSD值）分別為99.56% （0.58%）、100.37%（1.23%）、98.63%（0.59%）、99.11%（1.02%），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6.7 樣品含量測定 取10批次樣品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果見表6。

表6 10批抱莖獐牙菜中4種成分測定結(jié)果（n = 3）Tab. 6 Content results of 4 components in 10 batches of Swertia franchetiana（n = 3）

3 討論

10 批樣品指紋圖譜相似度在0.86以上，表明各樣品相似度較好，各色譜峰均達到基線分離，保留時間穩(wěn)定，16個共有峰通過與對照品對照指認出了10個成分，包含了抱莖獐牙菜主要有效成分，所建立的指紋圖譜可以作為抱莖獐牙菜的鑒別指標(biāo)之一。

聚類分析結(jié)果顯示10批抱莖獐牙菜分為兩類，分別為青海境內(nèi)自采樣品和四川境內(nèi)及藥材市場采購的樣品，顯示了抱莖獐牙菜成分與地域分布及采收儲存時間具有明顯相關(guān)性。含量測定以獐牙菜苦苷、芒果苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷作為指標(biāo)性成分。獐牙菜苦苷具有解痙鎮(zhèn)痛、清肝利膽、降血脂等多種作用，對多種實驗性肝損傷具有保護作用[8]；龍膽苦苷是龍膽科植物中的主要活性成分，主要用于保肝、抗炎、抗病原微生物、健胃利膽等[9-10]；芒果苷藥理學(xué)活性豐富，主要有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝等作用，另外體外實驗表明其對HBV-DNA復(fù)制具有明顯抑制作用[11-12]；當(dāng)藥苷是一種存在于多種中藥中的環(huán)烯醚萜類化合物，研究表明具有抗纖維化、抗炎、抗腫瘤等作用[13]。鑒于這4種成分在保肝利膽抗炎等方面均有明顯的藥理作用，且通過主成分分析表明其對主成分的貢獻較大，以這4種成分作為抱莖獐牙菜的質(zhì)量控制指標(biāo)成分較為合理，所建立的含量測定方法色譜峰分離效果好，簡便、快速、準(zhǔn)確，可以作為抱莖獐牙菜質(zhì)量控制方法。

4 結(jié)論

本試驗建立了10批抱莖獐牙菜的HPLC指紋圖譜和4種有效成分含量測定方法，方法穩(wěn)定性、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可為抱莖獐牙菜的鑒別和質(zhì)量控制提供參考。后續(xù)研究應(yīng)以有效成分作為指標(biāo)對獐牙菜屬以及其它種屬如扁蕾屬、花錨屬的植物進行考察和篩選，建立各種或?qū)俚臉?biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和質(zhì)量控制方法，進而為藏茵陳的持續(xù)開發(fā)提供依據(jù)。