白亮, 王寶太, 高志峰, 蔣安, 梁金強(qiáng)

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科,陜西省西安市710004)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，主要采用肝切除術(shù)和原位肝移植治療方案，HCC極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)期預(yù)后并不理想。因此，探討基于分子網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移是解決肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過(guò)與mRNA的3′-非編碼區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)結(jié)合，可靶向調(diào)控蛋白表達(dá)和功能，miRNA與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)[1]。miR-580表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)密切相關(guān)，其表達(dá)水平提高能明顯抑制兩種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且降低晚期腫瘤的臨床分級(jí)[2]。miRNA可充當(dāng)HCC致癌基因或腫瘤抑制基因，調(diào)控肝癌發(fā)生的始動(dòng)因素或者下游靶點(diǎn),例如miRNA-342-3p、miRNA-15a-3p、miRNA-140[3-4]，提示miRNA能夠作為肝癌防治的靶點(diǎn)，但miR-580尤其是miR-580-3p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡等的作用尚不完全明確，因此，本文對(duì)此進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

TRIzol試劑購(gòu)自廣州捷華生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；TaqMan MicroRNA Assay購(gòu)自北京斯科科技有限公司；TaqMan? Universal PCR Master Mix購(gòu)自昆明皇寶商貿(mào)有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自青島科創(chuàng)天地生物科技有限公司；Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biovision公司；HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自上海朝瑞生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廣州一科生物科技有限公司；siRNA(COL11A1)、COL11A1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、miR-580-3p inhibitor和miR-580-3p mimics均由北京擎科設(shè)計(jì)和合成。CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。

1.2 組織和細(xì)胞

納入2019年6月—2021年6月本院42例HCC手術(shù)患者的肝癌組織及癌旁組織。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療，均自愿參與本研究。本研究獲得了本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人正常肝細(xì)胞LO2、QSG-7701和人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7、Li-7、SK-Hep-1細(xì)胞系均購(gòu)自普諾賽公司，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基5%CO2、37 ℃培養(yǎng)至生長(zhǎng)期。分別將siCOL11A1(COL11A1敲低組)、COL11A1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(COL11A1過(guò)表達(dá)組)、miR-580-3p inhibitor(miR-580-3p敲低組)和miR-580-3p mimics(miR-580-3p過(guò)表達(dá)組)與轉(zhuǎn)染試劑混合后加入人肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)板孔中，轉(zhuǎn)染12 h后更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-580-3p和COL11A1 mRNA表達(dá)

采用TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s共45個(gè)循環(huán)。采用U6和GAPDH為內(nèi)參基因，用相對(duì)定量法計(jì)算基因表達(dá)量。引物序列GAPDH-F:5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，R:5′-AC ACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′；U6-F:5′-GAGGGCC TATTTCCCATGATT-3′，R:5′-TAATTAGAATTAATTT GACT-3′；COL11A1-F:5′-ACCCTCGCATTGACCTTC C-3′，R:5′-TTTGTGCAAAATCCCGTTGTTT-3′；miR-580-3p-F:5′-GACTATCGGGACATGTTA-3′，R:5′-GC AGGGTCCGAGGTATTC-3′。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組貼壁細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞3次，將Annexin-V-FITC、PI和HEPES緩沖液按比例配制成Annexin-V-FITC/PI染料溶液(1∶2∶50)用于凋亡細(xì)胞的染色，用HEPES緩沖液清洗后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。將人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7、Li-7、SK-Hep-1消化并固定在冰冷75%乙醇中，4 ℃過(guò)夜，碘化丙啶室溫下黑暗中孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)COL11A1、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K蛋白

提取總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白水平。30 μg總蛋白通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，80 V恒壓35 min，120 V 45 min。將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。COL11A1、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K、GAPDH抗體稀釋后加入膜上，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST緩沖液(含0.1%Tween-20 PBS緩沖液)洗膜3次，用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色條帶，定量灰度值。

1.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平(細(xì)胞活力)。相應(yīng)處理后，將人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7、Li-7、SK-Hep-1接種在96孔板培養(yǎng)1、2、3天。然后加入CCK-8試劑，孵育2 h后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度(OD)，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M450 nm處OD-空白孔450 nm處OD。

1.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

COL11A1 3′UTR區(qū)域的序列從肝癌細(xì)胞系HepG2的cDNA中進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物克隆到熒光素酶pmirGLO載體中，構(gòu)建野生型COL11A1-3′UTR-WT和突變型COL11A1-3′UTR-MT載體。然后將熒光素酶報(bào)告載體與每個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，以海腎熒光素酶表達(dá)載體pRL-TK為內(nèi)參。使用Promega的Digital-Luciferase Reporter Assay System檢查雙熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組miR-580-3p和COL11A1 mRNA表達(dá)的比較

與癌旁組織比較，肝癌組織COL11A1 mRNA表達(dá)升高、miR-580-3p表達(dá)降低；與人正常肝細(xì)胞系比較，人肝癌細(xì)胞系miR-580-3p表達(dá)降低、COL11A1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05；圖1)。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中COL11A1 mRNA表達(dá)與miR-580-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.429，P<0.05)。

圖1 肝癌組織與癌旁組織、人肝癌細(xì)胞系與人正常肝細(xì)胞COL11A1和miR-580-3p表達(dá)的比較

2.2 過(guò)表達(dá)或敲低miR-580-3p后肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的比較

與對(duì)照組比較，人肝癌細(xì)胞系增殖水平過(guò)表達(dá)miR-580-3p后降低，敲低miR-580-3p后升高(P<0.05)；人肝癌細(xì)胞系凋亡率過(guò)表達(dá)miR-580-3p后升高，敲低miR-580-3p后降低(P<0.05)；敲低miR-580-3p能夠誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞在G1/S細(xì)胞周期停滯(P<0.05；圖2)。

圖2 過(guò)表達(dá)或敲低miR-580-3p后肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的比較

2.3 miR-580-3p通過(guò)靶向抑制COL11A1調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡

通過(guò)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析發(fā)現(xiàn)，miR-580-3p具有多個(gè)潛在靶基因，敲低COL11A1時(shí)HepG2細(xì)胞凋亡率上升(P<0.05，圖3)。人肝癌細(xì)胞系凋亡率過(guò)表達(dá)COL11A1后降低，敲低COL11A1后上升；人肝癌細(xì)胞COL11A1 mRNA水平過(guò)表達(dá)miR-580-3p后降低，敲低miR-580-3p后升高(P<0.05；圖3)。

圖3 miR-580-3p通過(guò)靶向抑制COL11A1調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡

2.4 Akt和PI3K參與miR-580-3p/COL11A1介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)

肝癌細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K水平在COL11A1過(guò)表達(dá)和miR-580-3p敲低后顯著升高，而總Akt、PI3K表達(dá)保持不變；肝癌細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K水平在COL11A1敲低或miR-580-3p過(guò)表達(dá)后降低，而總Akt、PI3K水平不變(圖4)。

圖4 Akt和PI3K 參與miR-580-3p/COL11A1介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)

3 討 論

HCC是第五大侵襲性癌癥，已成為全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[5]，但只有少數(shù)早期確診的病例能夠通過(guò)手術(shù)切除或肝移植治愈[6]，大多數(shù)患者會(huì)因腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而發(fā)展為晚期疾病，導(dǎo)致生存率低[7]。基于小分子網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)探索抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移可能成為肝癌的防治靶點(diǎn)，因此，本文探究了miR-580-3p和COL11A1在肝癌發(fā)生中的作用。

miRNA是一種小的非編碼單鏈RNA[8]，可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中充當(dāng)腫瘤抑制因子或啟動(dòng)因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，肝癌組織中miR-580-3p表達(dá)下調(diào)。與人正常肝細(xì)胞系比較，人肝癌細(xì)胞系miR-580-3p表達(dá)下調(diào)，提示miR-580-3p可能在肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。隨后，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-580-3p后，人肝癌細(xì)胞系增殖降低，凋亡率升高。相反，miR-580-3p敲低后，人肝癌細(xì)胞增殖升高，凋亡率降低，細(xì)胞周期停滯在G1/S期。因此，本研究發(fā)現(xiàn)miR-580-3p可以調(diào)控細(xì)胞周期參與肝癌細(xì)胞增殖和凋亡，提示肝癌細(xì)胞中miR-580-3p水平降低是肝癌發(fā)生的一個(gè)始動(dòng)因素。

如上文所述，miR-580-3p水平降低可能是肝癌發(fā)生的一個(gè)始動(dòng)因素，那么miR-580-3p是通過(guò)下游什么途徑發(fā)揮作用的呢？既往研究指出，COL11A1是肝癌細(xì)胞增殖過(guò)程中的一個(gè)下游調(diào)控分子，肝癌細(xì)胞COL11A1表達(dá)水平是升高的[10]，這與本文結(jié)果類似。那么，COL11A1是否是miR-580-3p的一個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)呢？本研究發(fā)現(xiàn)，COL11A1是miR-580-3p的一個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)；過(guò)表達(dá)miR-580-3p后，人肝癌細(xì)胞系COL11A1 mRNA水平降低；敲低miR-580-3p后，人肝癌細(xì)胞系COL11A1 mRNA水平升高。因此，miR-580-3p可以靶向調(diào)控COL11A1的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)COL11A1后人肝癌細(xì)胞凋亡率降低；相反，敲低COL11A1后人肝癌細(xì)胞凋亡率上升。以上結(jié)果提示，miR-580-3p可以通過(guò)COL11A1的表達(dá)發(fā)揮抗肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡作用。

有研究已發(fā)現(xiàn)，COL11A1與多種實(shí)體瘤(包括肺癌)中的癌癥遷移有關(guān)[11]，且有望成為有效的非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)志物[12-13]，然而在肝癌中尚無(wú)COL11A1相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)敲低COL11A1能夠抑制肝癌細(xì)胞凋亡，并且miR-580-3p的抗腫瘤功能能夠通過(guò)COL11A1介導(dǎo)。那么，COL11A1和miR-580-3p的表達(dá)水平變化能否反映肝癌的進(jìn)程還需要進(jìn)一步探究。

除了miR-580-3p和COL11A1在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用外，本研究還評(píng)估了其潛在的作用機(jī)制。據(jù)報(bào)道，PI3K/Akt是COL11A1的下游介質(zhì)，而Akt抑制劑具有逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞中的順鉑耐藥性的功能[14-15]。與既往研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中敲低COL11A1或過(guò)表達(dá)miR-580-3p后，p-Akt和p-PI3K的表達(dá)均顯著降低。據(jù)此推測(cè)，miR-580-3p和COL11A1可能是HCC的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，肝癌細(xì)胞和肝癌組織中miR-580-3p的表達(dá)水平降低，miR-580-3p/COL11A1軸可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt通路影響肝癌細(xì)胞的凋亡。