潘志兵, 李娟, 蘇堅, 夏紅, 劉芳, 蘇琦

(1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所 湖南省腫瘤細胞與分子病理學(xué)重點實驗室，湖南省衡陽市 421001；2.婁底市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南省婁底市 417000；3.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，湖南省衡陽市 421001)

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率分別居于全球第三位與第二位[1]。由于結(jié)腸癌患者就診時大多已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，從而手術(shù)、化療、放療等療效差，死亡率高于50%[2]。因此，研究結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找其關(guān)鍵標(biāo)記，為靶向干預(yù)治療及對結(jié)腸癌的防治具有重要意義。

LIM激酶1(LIM domain kinase 1，LIMK1)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，可通過磷酸化和失活肌動蛋白解聚因子cofilin調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合，調(diào)控腫瘤細胞增殖、細胞周期與侵襲轉(zhuǎn)移等[3]。大量文獻表明，LIMK1在人類各種類型癌癥中異常調(diào)控，促進癌癥進展[3-8]。課題組前期工作證明，LIMK1在胃癌與結(jié)腸癌中高表達與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)[9-10]。本研究探討LIMK1高表達對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖、遷移、侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

LIMK1與β-actin抗體(Abcam公司)，p-LIMK1、cofilin1、p-cofilin1(Abzoom公司)，Rac1(Millipore公司)，Pak1(Epitomics公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，RT reagent Kit、pMD18-T vector(TaKaRa公司)，PCR試劑盒(Promega公司)，DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP、LipofectamineTM2000、殺稻瘟菌素、oligo DNA、platinum Pfx DNA Polymerase(Invitrogen公司)，BglII、SalI、T4 DNA ligase(NEB公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)，ECL發(fā)光檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒與壯觀霉素(Sigma公司)，Transwell小室(Corning公司)，Matrigel(BD公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

人結(jié)腸癌SW480細胞系南華大學(xué)腫瘤研究所保存。培養(yǎng)于10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2恒濕培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。實驗分為空載體組、SW480組、LIMK1高表達組(LIMK1/SW480組)。

1.3 構(gòu)建真核表達載體

設(shè)計與合成引物序列LIMK1：F 5′-GGGGCATCATCAAGAGCA-3′，R 5′-CCAGGCAGTTGTGGGAGT-3′。將合成好的LIMK1序列裝入pMD18-T載體，再轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α。BglII/SalI將TA克隆質(zhì)粒酶切，37 ℃酶切2 h，酶切體系：10×buffer 5 μL，TA克隆質(zhì)粒5 μL，BglII 1 μL，SalI 1 μL，ddH2O 38 μL。BglII/SalI將pIRES2-EGFP酶切，37 ℃酶切2 h，酶切體系：10×buffer 5 μL，pIRES2-EGFP 2 μL，BglII 1 μL，SalI 1 μL，ddH2O 41 μL。電泳并回收酶切的LIMK1片段。用T4 DNA ligase連接回收的片段與載體，室溫連接2 h。從每個轉(zhuǎn)化平板上分別挑取4個克隆，搖菌并抽提質(zhì)粒進行測序驗證。

1.4 建立穩(wěn)定高表達LIMK1基因SW480細胞

1×105/mL SW480細胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，取出6孔板，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，再換1.5 mL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基洗滌3次，放回培養(yǎng)箱中。將4.0 μg的質(zhì)粒DNA(pIRES2-EGFP-LIMK1真核表達載體和pIRES2-EGFP空載體)用無血清的Opti-MEM稀釋，最終體積為250 μL，并標(biāo)記為A液。10 μL LipofectamineTM2000加到240 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，標(biāo)記為B液。孵育5 min后，將A與B液混合得到C液，混勻后室溫中孵育20 min。將500 μL C液加到6孔培養(yǎng)板，輕輕搖勻，培養(yǎng)6 h，吸棄原培養(yǎng)液，更換為含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)液。48 h后將孔內(nèi)細胞以1∶10比例傳代。培養(yǎng)24 h后，用含G418終質(zhì)量濃度為500 mg/L的RPMI-1640完全細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)并篩選陽性克隆SW480細胞，隔天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)14天后，挑取發(fā)綠色熒光的陽性克隆細胞至96孔板，待形成陽性單克隆細胞后再挑取至24孔板擴大培養(yǎng)，以250 mg/L G418作為維持質(zhì)量濃度，反復(fù)3～4次，最后移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)并凍存。

1.5 RT-PCR檢測

RNA試劑盒提取細胞總RNA，AMV酶作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物序列：LIMK1：F 5′-GGGGCATCATCAAGAGCA-3′，R 5′-CCAGGCAGTTGTGGGAGT-3′，138 bp；β-actin：F 5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3′，R 5′-TGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′，367 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；94 ℃，40 s；52.3 ℃，45 s；72 ℃ 80 s，28個循環(huán)；72 ℃ 10 min。5 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳，嗅化乙啶染色，IS1000圖像分析軟件讀取條帶灰度值。

1.6 Western blotting

收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定。每組取等量樣本進行凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，采用ECL發(fā)光法，最后X片曝光、顯影、定影。

1.7 MTT檢測

取對數(shù)生長期SW480細胞，接種到96孔板，每組設(shè)置6個復(fù)孔；細胞貼壁4～6 h后，更換細胞培養(yǎng)基為150 μL RPMI-1640完全細胞培養(yǎng)基，再加入20 μL 5 g/L MTT溶液，培養(yǎng)4 h；吸棄上清液，加入150 μL DMSO溶液；搖床上平搖10～15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔在570 nm處光密度值(OD)。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD570/對照組OD570 nm)×100%。

1.8 流式細胞術(shù)檢測

取對數(shù)生長期SW480細胞，4 ℃預(yù)冷PBS液重懸細胞，800 r/min離心5 min，加入4 ℃預(yù)冷70%乙醇固定。檢測前，將固定的細胞800 r/min離心5 min，預(yù)冷PBS液洗滌1次，加入RNA酶50 μL，37 ℃水浴30 min，然后加1 g/L碘化丙啶50 μL，避光振蕩混勻，4 ℃放置30 min，300目尼龍網(wǎng)濾過，上機檢測，進行細胞周期分析。

1.9 劃痕實驗

調(diào)整細胞為1×106/mL，吸1 mL細胞懸液接種于6孔板，每組3個平行樣本。RPMI 1640培養(yǎng)液37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，直至形成細胞單層。用Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，無血清培養(yǎng)液洗細胞3次，加新鮮無血清培養(yǎng)基。顯微鏡下測量劃痕區(qū)相對距離，實驗重復(fù)3次。

1.10 侵襲實驗

將基質(zhì)膠稀釋液鋪置在Transwell小室中，放置成膜。100 μL細胞稀釋液接種至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)液添加至下腔，小室放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出，擦棄小室上層細胞并用4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶祡染色。顯微鏡下隨機選取4個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值。每組細胞設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LIMK1高表達SW480穩(wěn)定細胞系構(gòu)建

LIMK1基因cDNA序列與真核表達載體pIRES2-EGFP連接，獲得pIRES2-EGFP-LIMK1重組真核表達載體，取部分質(zhì)粒進行BglII和SalI雙酶切鑒定(圖1A)。抽提質(zhì)粒后進行測序，插入序列與LIMK1全長cDNA的GenBank序列完全一致，表明LIMK1全長cDNA已經(jīng)成功連接到pIRES2-EGFP載體上。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細胞24 h后，倒置熒光顯微鏡可見綠色熒光。加入G418(500 mg/L)篩選14天后，可見陽性克隆細胞(圖1B)，挑選克隆細胞加G418繼續(xù)培養(yǎng)(圖1C)。

轉(zhuǎn)染空載體的SW480細胞LIMK1 mRNA和蛋白表達與SW480細胞均無明顯差異(P>0.05)。LIMK1真核表達載體轉(zhuǎn)染SW480細胞后，LIMK1 mRNA和蛋白表達均明顯增加(P<0.05)，表明成功構(gòu)建穩(wěn)定高表達LIMK1基因的SW480細胞(圖1D和E)。

圖1 LIMK1高表達SW480細胞的構(gòu)建

2.2 LIMK1高表達對SW480細胞增殖、細胞周期的影響

LIMK1/SW480組細胞增殖能力高于SW480組和空載體組(P<0.05;圖2A)，提示LIMK1高表達對SW480細胞增殖具有促進作用。

LIMK1/SW480組G2/M期細胞百分率較SW480組和空載體組明顯降低(P<0.05)。表明LIMK1高表達可抑制SW480細胞G2/M期阻滯作用(圖2B、C、D)。

圖2 LIMK1高表達對SW480細胞增殖和細胞周期的影響

2.3 LIMK1高表達對SW480細胞遷移能力影響

0 h時，各組遷移距離基本相同。劃痕24 h后，LIMK1/SW480組瘢痕距離[(12.6±0.73)μm]明顯低于SW480組[(36.0±0.50)μm]和空載體組[(37.8±0.63)μm](P<0.05)。表明LIMK1高表達可促進SW480細胞遷移(圖3)。

圖3 LIMK1高表達對SW480細胞遷移的影響

2.4 LIMK1高表達對SW480細胞侵襲能力的影響

LIMK1/SW480組穿膜細胞數(shù)(174±6.95)明顯多于SW480組(102±9.94)和空載體組(99±8.28)，差異有顯著性(P<0.05)。表明LIMK1高表達可促進SW480細胞侵襲(圖4)。

圖4 LIMK1高表達對SW480細胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，40×)

2.5 LIMK1高表達對SW480細胞LIMK1/cofilin1通路的影響

LIMK1/SW480組LIMK1、p-LIMK1、cofilin1較空載體組與SW480細胞組表達上調(diào)(P<0.05；圖5)。表明LIMK1高表達可上調(diào)LIMK1，促進LIMK1與cofilin1的磷酸化。

圖5 LIMK1高表達對SW480細胞通路影響

3 討 論

LIMK1在多種腫瘤中高表達與遷移侵襲有關(guān)。在一項臨床隊列研究中，高水平的LIMK1患者顯示出明顯較低的總生存率和較大的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛力[3]。在結(jié)直腸癌組織中，LIMK1高表達與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良密切相關(guān)。上調(diào)LIMK1可促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)與激活PI3K/Akt通路，增加增殖和遷移與移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，而沉默LIMK1效果相反[4]。肺腺癌組織中LIMK1高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和不良預(yù)后相關(guān)，表明LIMK1可以作為肺腺癌不良預(yù)后的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點[5]。前列腺癌LIMK1表達明顯高于良性前列腺增生。LIMK1上調(diào)與前列腺體積、PSA及其抗原密度、Gleason評分、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、囊外擴展和精囊侵襲、手術(shù)邊緣陽性密切相關(guān)。分析顯示，LIMK1是前列腺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與生存縮短的獨立危險因素[6]。LIMK1在胃癌中高表達，并且胃癌腹膜轉(zhuǎn)移較原發(fā)性胃癌中LIMK1表達增加，敲除LIMK1可下調(diào)p-cofilin顯著抑制胃癌細胞的遷移和侵襲以及消除裸鼠體內(nèi)胃癌細胞的腹膜和肝轉(zhuǎn)移[7]。

LIMK1/cofilin1通路在調(diào)控腫瘤細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。在骨肉瘤組織和細胞中PAK4、LIMK1和cofilin-1均高表達，并與臨床分期、遠處轉(zhuǎn)移和腫瘤分級相關(guān)。沉默PAK4可通過降低LIMK1/cofilin-1通路的活性抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移與裸鼠移植瘤生長[8]。SphK2與S1P可通過激活PAK1/LIMK1/cofilin1信號通路促進三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移[11]。LncRNA DANCR在肝癌中高表達，與增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且DANCR可通過誘導(dǎo)miR-27a-3p調(diào)控ROCK1/LIMK1/cofilin1通路，促進肝癌的發(fā)展，誘導(dǎo)EMT[12]。在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)LINC00941和ROCK1高表達，而miR-335-5p低表達。沉默LINC00941可抑制胰腺癌細胞生長、轉(zhuǎn)移和EMT。LINC00941作為miR-335-5p的分子海綿和ROCK1的ceRNA，可促進ROCK1上調(diào)和激活LIMK1/cofilin-1通路[13]。

本研究結(jié)果顯示，采用真核表達載體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建高表達LIMK1基因的SW480細胞，LIMK1高表達可通過LIMK1/cofilin1通路上調(diào)LIMK1和激活LIMK1與cofilin1促進SW480細胞增殖與遷移侵襲。因此，LIMK1可能是診治結(jié)腸癌的靶點。

目前，靶向LIMK1的有效抑制劑和小分子化合物的研發(fā)成為抗腫瘤治療的新途徑。研究發(fā)現(xiàn)，土木香內(nèi)酯(ATL)通過靶向抑制LIMK酶活性激活cofilin，從而上調(diào)Gactin/Factin比值，抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲[14]。Dasatinib可直接靶向LIMK1下調(diào)p-LIMK1和p-cofilin，抑制cyclin D1、D3和CDK2表達，阻滯細胞在G1期，增加Caspase-3和Caspase-7表達誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制高表達LIMK1的SCID小鼠移植瘤生長，表明Dasatinib是一種治療肺癌的新型LIMK1抑制劑[15]。Luteolin靶向LIMK1下調(diào)LIMK1通路相關(guān)靶點p-LIMK和p-cofilin，增加Caspase-3水平，降低cyclin D1表達，誘導(dǎo)細胞凋亡和阻滯細胞在G1期。此外，Luteolin通過降低體內(nèi)Ki-67、p-LIMK和p-cofilin的表達抑制移植瘤的生長[16]。

課題組前期工作證實，LIMK1在結(jié)腸癌高表達與腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)[10]。大蒜的有效成分二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)可下調(diào)LIMK1抑制結(jié)腸癌細胞遷移與侵襲，沉默LIMK1可增強DADS抑制作用[17-19]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)LIMK1是DADS作用人胃癌細胞的潛在靶點[20]。同時證明，DADS通過下調(diào)LIMK1抑制人胃癌細胞EMT與侵襲，而沉默LIMK1抑制人胃癌細胞遷移與侵襲[9,21]。然而，DADS是否可阻斷LIMK1/cofilin通路抑制結(jié)腸癌細胞遷移侵襲，尚待進一步研究。