龍思鴻， 謝群， 孫珊珊， 曹琴， 曾匯文， 賀莉萍

(湘南學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省郴州市 423099)

艱難梭菌是一種厭氧的、能夠形成孢子、寄生在哺乳動(dòng)物腸道中的革蘭氏陽性桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境、動(dòng)物和人的糞便中。艱難梭菌本身并沒有侵襲性，但研究發(fā)現(xiàn)，長期使用廣譜抗生素，尤其是克林霉素、頭孢菌素類、喹諾酮類抗生素后[1]，可改變正常的腸道微生物組，引起菌群失調(diào)，使耐藥的艱難梭菌孢子萌發(fā)，隨后使細(xì)菌定植和增殖，出現(xiàn)艱難梭菌相關(guān)性感染，可導(dǎo)致腹瀉、假膜性結(jié)腸炎、中毒性巨結(jié)腸，在極端情況下可導(dǎo)致器官衰竭，從而導(dǎo)致死亡。艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)具有復(fù)發(fā)率高、耐藥率高、難治率高、病死率高、醫(yī)療費(fèi)用高等特點(diǎn)[2-4]，CDI疾病嚴(yán)格依賴于產(chǎn)毒梭菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)毒素，因此，如何盡早快速檢測艱難梭菌毒素，盡早識別CDI，對該病的診療與預(yù)防具有重要意義。本文對艱難梭菌毒素的生物學(xué)和艱難梭菌毒素及其基因檢測方法的研究進(jìn)展做一綜述，旨在為艱難梭菌感染防治提供參考。

1 艱難梭菌毒素

艱難梭菌有不產(chǎn)毒菌株和產(chǎn)毒菌株，而CDI嚴(yán)格依賴于產(chǎn)毒梭菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)毒素[1]。艱難梭菌產(chǎn)毒菌株能夠產(chǎn)生毒素A(TcdA)、毒素B(TcdB)、毒素C(TcdC)、毒素R(TcdR)、毒素E(TcdE)及艱難梭菌轉(zhuǎn)移酶毒素(binary toxin,CDT)等6種毒素。

1.1 TcdA和TcdB

TcdA和TcdB是導(dǎo)致腹瀉和結(jié)腸炎的主要毒素，TcdA和TcdB屬于大型梭狀芽胞桿菌葡萄糖基化毒素家族，TcdA為腸毒素，可引起腸道黏膜損傷;TcdB是細(xì)胞毒素，可刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子引起炎性反應(yīng)，使腸黏膜細(xì)胞變性、凋亡甚至壞死和脫落[5]。在動(dòng)物模型(倉鼠和家兔)中，TcdA在增加分泌、腸黏膜損傷和炎癥方面比TcdB更有效[6]，但在大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物中，TcdB比TcdA更有效，因此，TcdB被命名為細(xì)胞毒素[5]。

TcdA(308 kDa，Acc.Nr.P16154)和TcdB(270 kDa，Acc.Nr.P18177)分別具有2 710和2 366個(gè)氨基酸，且其氨基酸序列同源性達(dá)48%。TcdA和TcdB由至少4個(gè)主要功能域組成[7-8]：結(jié)構(gòu)域A是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性域(GTD)；域B由組合的重復(fù)寡肽(CROPs)組成，并參與受體結(jié)合；域C是一個(gè)自體蛋白酶結(jié)構(gòu)域(APD)，通過三螺旋束連接到結(jié)構(gòu)域D；域D參與遞送及與宿主細(xì)胞的結(jié)合。在結(jié)構(gòu)域D中有一個(gè)疏水性序列(HP)，可能在毒素易位中起作用(圖1)[7]。

圖1 艱難梭菌毒素A(TcdA)和B(TcdB)的結(jié)構(gòu)[7]

1.2 CDT

CDT又稱二元毒素，是一種肌動(dòng)蛋白特異的ADP核糖轉(zhuǎn)移酶[8]，CDT主要通過破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，導(dǎo)致細(xì)胞液流出，最終造成細(xì)胞死亡[9]。臨床上約5%～30%的艱難梭菌分離物產(chǎn)生CDT，其與更嚴(yán)重的疾病有關(guān)[10]。

CDT同時(shí)由二元毒素位點(diǎn)(Cdt Loc)上的CdtA和CdtB編碼[11]。CDT由兩個(gè)獨(dú)立的組分組成：CDTa(48 kDa，菌株CD196)是修飾肌動(dòng)蛋白的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(ADP-ribosyltransferase，ART)，由兩個(gè)相同折疊的結(jié)構(gòu)域組成[12]，N端結(jié)構(gòu)域充當(dāng)適配器并與結(jié)合組分CDTb相互作用，CDTb參與受體結(jié)合和毒素?cái)z取，而C端結(jié)構(gòu)域具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)合成分CDTb(98.8 kDa，876個(gè)氨基酸)可分為4個(gè)結(jié)構(gòu)域。N端257個(gè)殘基形成蛋白酶激活域I參與了膜的插入和孔的形成。結(jié)構(gòu)域III(氨基酸481～591)參與寡聚化，而C端結(jié)構(gòu)域IV(氨基酸592～876)參與受體結(jié)合(圖2)[7]。

圖2 艱難梭菌轉(zhuǎn)移酶毒素(CDT)的結(jié)構(gòu)[7]

1.3 TcdC、TcdR和TcdE

tcdC和tcdR基因?yàn)榫幋aTcdC和TcdR調(diào)節(jié)基因,TcdC為抗轉(zhuǎn)錄起始因子，具有對tcdA和tcdB基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，TcdR為聚合酶轉(zhuǎn)錄起始因子，能與tcdA和tcdB毒素基因上游的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，具有對tcdA和tcdB基因轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)作用[13]。TcdE可促進(jìn)毒素從細(xì)胞內(nèi)釋放，對CDI起到輔助作用[14]。

2 艱難梭菌毒素的檢測方法

2.1 產(chǎn)毒素培養(yǎng)

產(chǎn)毒素培養(yǎng)作為業(yè)內(nèi)金標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性高。該技術(shù)基于從糞便樣本(或直腸拭子)中分離出細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行A/B毒素的免疫學(xué)檢測或PCR來檢測所回收分離物的產(chǎn)毒能力[15]。由于需觀察2～5天，且特異性較低，不建議實(shí)驗(yàn)室將該法作為獨(dú)立的檢測方法。

2.2 細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)

細(xì)胞毒素中和試驗(yàn)(cell cytotoxicity neutralization assay，CCNA)是最早開發(fā)的CDI診斷方法，主要用于檢測TcdB[16]。該法采用人成纖維細(xì)胞(通常為Vero細(xì)胞)培養(yǎng)于擬檢測的糞便濾液中，觀察細(xì)胞是否產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，如果產(chǎn)生CPE，則再加入特定的艱難梭菌抗毒素血清進(jìn)行中和，若超過50%的病變細(xì)胞被中和則判定為CCNA陽性[16]。CCNA與TC一同被認(rèn)為是艱難梭菌毒素檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。CCNA的敏感性隨細(xì)胞系選擇和抗生素濫用的預(yù)處理而變化；若患者未得到及時(shí)診斷，則可能出現(xiàn)假陽性[17]?？傊珻CNA是一種更便捷的檢測方法，盡管有其固有的局限性，但仍是常規(guī)診斷的驗(yàn)證性檢測。

2.3 免疫學(xué)檢測(A/B EIAs)

TcdA、TcdB和CDT都是大分子蛋白質(zhì)，可以通過特定的單克隆或多克隆抗體進(jìn)行識別。近年來，針對艱難梭菌毒素的酶聯(lián)免疫技術(shù)因其價(jià)格低廉、快速簡便且易于操作等優(yōu)點(diǎn)而成為實(shí)驗(yàn)室診斷CDI最常用的檢測方法，法國梅里埃的VIDAS CDAB檢測是首個(gè)獲批且目前在國內(nèi)應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測方法[18]。采用免疫學(xué)方法可在1～2 h內(nèi)完成檢測，其靈敏度為69%～99%，特異度為94%～100%[19]，靈敏度波動(dòng)范圍較大可能與不同菌株毒素的抗原變異、標(biāo)本儲(chǔ)存條件及實(shí)驗(yàn)室操作等因素有關(guān)，因此不宜作為CDI的單一診斷手段，臨床上常聯(lián)合谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)檢測法共同診斷CDI。

2.4 谷氨酸脫氫酶檢測

谷氨酸脫氫酶是一種產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒菌株均可合成的代謝酶，是艱難梭菌表面表達(dá)的抗原性蛋白，具有較高的穩(wěn)定性和靈敏性。GDH可以通過酶免疫測定方法被特異性抗體識別。GDH檢測不屬于毒素的檢測試驗(yàn)方法，但臨床上通常聯(lián)合應(yīng)用毒素的免疫學(xué)檢測法共同診斷CDI。GDH檢測不能區(qū)分產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株，但由于其高度的敏感性，具有較高的陰性預(yù)測值，陰性結(jié)果可基本排除CDI，加上其低成本優(yōu)勢，GDH可作為診斷前的篩選手段，以確定哪些樣品應(yīng)進(jìn)行毒素A/B EIAs或毒素的核酸檢測[20]。

2.5 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析

實(shí)時(shí)細(xì)胞分析(realtimecellularanalysis，RTCA)是一種基于微電子傳感器的細(xì)胞分析技術(shù)，采用磁珠標(biāo)記TcdB的特異性抗體，通過中和抗體可準(zhǔn)確鑒定艱難梭菌毒。新一代(二代)RTCA系統(tǒng)采用單個(gè)細(xì)胞孔可準(zhǔn)確鑒定艱難梭菌，應(yīng)用RTCA檢測艱難梭菌毒株時(shí)，其毒素水平與CDI疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[21]。

2.6 毒素核酸擴(kuò)增法檢測

核酸擴(kuò)增法檢測(nucleic acid amplification tests，NAAT)主要包括實(shí)時(shí)PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和依賴解旋酶DNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Helicase-dependent Isothermal DNA Amplification,HDA)三大類，用于檢測編碼和調(diào)節(jié)毒素生成的致病基因tcdA、tcdB及tcdC的Δ117缺失(表1)。

表1 艱難梭菌毒素核酸擴(kuò)增法(NAAT)性能的比較[22-23]

2.6.1 實(shí)時(shí)PCR法 BD Gene Ohm檢測采用分子信標(biāo)探針直接從糞便中檢測艱難梭菌tcdB。BD Gene Ohm的缺點(diǎn)是需手工提取DNA(45 min)。BD MAXTMC. difficile檢測與BD Gene Ohm針對的是同一段tcdB基因序列，其最大優(yōu)勢是通過儀器自動(dòng)提取DNA，大大縮短了手工操作時(shí)間。對同一批陽性標(biāo)本而言，BD Max法較BD Gene Ohm敏感性更高，循環(huán)閾值更低。BioFire FilmArray?GI Panel檢測采用巢式多重PCR分析技術(shù)檢測tcdA和tcdB。該法將樣本核酸的制備、擴(kuò)增、檢測和分析過程整合為一體，具有易于使用、準(zhǔn)確快速等特點(diǎn)。只需2 min手工操作時(shí)間。ProGastro Cd PCR檢測利用easyMAG自動(dòng)提取DNA，采用Taq-man探針法檢測tcdB，但其整個(gè)過程約3 h。Cepheid GeneXpertC. difficile檢測是美國FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)全自動(dòng)tcdB分子檢測方法，可同時(shí)檢測二元毒素基因tcdB、cdt和tcdC的Δ117缺失。IMDx for C. difficile Abbottm2000檢測可同時(shí)檢測tcdA、tcdB以及tcdB的變異基因tcdBv。Nanosphere Verigene檢測采用多重PCR，將終點(diǎn)PCR擴(kuò)增與基于納米顆粒的微陣列雜交技術(shù)相結(jié)合，可同時(shí)檢測tcdA、tcdB、cdt和tcdCΔ117。Verigene檢測一次只能檢測1個(gè)標(biāo)本，不能高通量操作。

2.6.2 LAMP LAMP是在2000年左右發(fā)展起來的，20多年來一直被用于鑒定PCR核糖體分型027菌株，具有高敏感性(100%)和特異性(98%)。目前一項(xiàng)新的研究建立了一種可視化LAMP方法，該方法對CdtA和CdtB的檢測限為24.8 pg/L，比傳統(tǒng)的PCR檢測法高10倍。IllumigeneTMC. difficile檢測的是艱難梭菌毒素A的編碼基因tcdA 5′端的保守區(qū)域,可檢測出tcdA-tcdB+的菌株。該檢測法不需要PCR擴(kuò)增儀，操作簡單，整個(gè)過程約60 min。

2.6.3 HDA HDA是于2004年建立的一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)在恒溫條件下利用解旋酶解開DNA雙鏈,以解開的單鏈作為模板,由DNA聚合酶催化合成互補(bǔ)鏈，循環(huán)擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)式增長。Great Basin Portrait Analyzer法將blockedprimer HDA(bpHDA)技術(shù)與芯片技術(shù)相結(jié)合，檢測艱難梭菌毒素基因tcdB。QuidelAmpliVue C. difficile法采用解旋酶擴(kuò)增法結(jié)合恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增tcdA 5′端的保守區(qū)域，然后采用自帶層析試紙條檢測結(jié)果。手提式、便于攜帶是AmpliVue的最大優(yōu)勢，特別適用于標(biāo)本量少的實(shí)驗(yàn)室。

比較以上毒素檢測方法，NAAT法敏感性高、特異性好、操作簡單、耗時(shí)短，結(jié)果陰性可迅速排除CDI，陽性則可及時(shí)采取治療和隔離措施，這對于CDI暴發(fā)性感染的控制顯得尤為重要。雖然現(xiàn)階段對艱難梭菌毒素的結(jié)構(gòu)、功能關(guān)系和作用模式有了一定了解，但其致病機(jī)制尚未完全闡明，檢測技術(shù)也不很成熟，到目前為止，還沒有一種方法可以對艱難梭菌感染進(jìn)行單獨(dú)診斷；另外，檢測方法組合使用不當(dāng)也可導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)CDI的假爆發(fā)，出現(xiàn)較多的假陽性病例。

3 展 望

為了更有效地識別艱難梭菌以防治CDI，應(yīng)該更深入地了解艱難梭菌的毒素生物學(xué)及發(fā)病機(jī)制，積極開發(fā)實(shí)時(shí)、快速、高通量、高靈敏度和高特異度的更經(jīng)濟(jì)有效的檢測方法與技術(shù)，基于NAAT和微陣列技術(shù)的自動(dòng)化檢測仍然是CDI診斷的待發(fā)展領(lǐng)域。