楊劍波， 曹倪豪， 程飛， 梁增亮， 楊菲

(南通市海門區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇省南通市 226100)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，常采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)治療?；熢诎螂装┑闹委熤邪l(fā)揮重要作用，但化療產(chǎn)生的不良反應(yīng)較大并可產(chǎn)生化療耐藥性，因而尋找安全有效的抗膀胱癌藥物具有重要意義。研究表明，部分中醫(yī)藥可起到抑制膀胱癌的作用，然而尚未明確其作用機制[1-3]。土貝母苷甲是土貝母的主要活性成分，可通過誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，通過調(diào)控miR-21表達而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖及促進細胞凋亡[4]。miRNA可通過靶向調(diào)節(jié)靶mRNA而調(diào)控細胞增殖及凋亡等生物學(xué)行為。研究表明，miR-215-5p在前列腺癌中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移[5]，但miR-215-5p是否可作為土貝母苷甲治療膀胱癌的潛在靶點尚未可知。本研究探討土貝母苷甲在膀胱癌中的抗癌作用，并通過miR-215-5p探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 試劑

土貝母苷甲(上海一研生物公司)；人膀胱癌細胞T24(南京科佰生物公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；Matrigel基質(zhì)膠、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、Transwell小室、CCK-8試劑(北京索萊寶公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑與熒光定量PCR試劑(北京天根生化公司)；miR-215-5p mimics、anti-miR-215-5p、miR-NC、anti-miR-NC(廣州銳博生物公司)；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、MMP-9抗體、二抗(美國Santa Cruz公司)；RNA提取試劑(北京全式金生物公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

于96孔板(100 μL/孔)接種對數(shù)生長期T24細胞，分別加入不同質(zhì)量濃度(10、20、30 mg/L)土貝母苷甲培養(yǎng)基處理24 h[6]，分別記為低劑量組、中劑量組、高劑量組；同時將正常培養(yǎng)的T24細胞記為對照組；將miR-NC、miR-215-5p mimics分別轉(zhuǎn)染至T24細胞，分別記為miR-NC組、miR-215-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-215-5p分別轉(zhuǎn)染至T24細胞，轉(zhuǎn)染成功后加入30 mg/L土貝母苷甲培養(yǎng)基處理24 h，分別記為土貝母苷甲30 mg/L+anti-miR-NC組、土貝母苷甲30 mg/L+anti-miR-215-5p組。

1.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖

各組T24細胞以100 μL/孔接種于96孔板，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃恒溫箱孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度(OD)值并計算細胞存活率。

1.4 平板克隆形成實驗

各組T24細胞以500個/孔接種于6孔板，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)14天，當(dāng)出現(xiàn)細胞集落時棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛進行細胞固定20 min，并以1%結(jié)晶紫染色處理20 min，采用PBS洗滌后將其晾干，最后進行細胞計數(shù)。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲

遷移檢測：采取無血清培養(yǎng)基處理各組T24細胞，獲得單細胞懸液(細胞濃度1×105個/mL)，上室接種控制為100 μL/孔，并在下室放入600 μL完全培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)24 h,加入多聚甲醛予以細胞固定20 min，然后結(jié)晶紫連續(xù)染色20 min，進行漂洗晾干，記錄顯微鏡計數(shù)結(jié)果。侵襲檢測：混勻培養(yǎng)基以及Matrigel基質(zhì)膠，二者比例為1∶6，并將40 μL稀釋液放入上室，37 ℃恒溫箱凝固處理4 h備用,其他步驟同遷移測定。

1.6 qRT-PCR檢測細胞miR-215-5p水平

用RNA提取試劑提取各組T24細胞總RNA，按照試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄及完成qRT-PCR過程。2-ΔΔCt法計算miR-215-5p相對表達量(U6為內(nèi)參)。

1.7 Western blotting檢測MMP-2、MMP-9蛋白

用二喹啉甲酸法測定蛋白水平，緩沖液加入50 μg蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，用MMP-2(1∶1 000)、內(nèi)參GAPDH(1∶2 000)、MMP-9(1∶1 000)一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，再用二抗稀釋液(1∶5 000)室溫孵育1 h。Image J軟件獲得蛋白相對灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 土貝母苷甲對T24細胞增殖及克隆形成的影響

與對照組比較，低、中、高劑量組細胞存活率降低(P<0.05)，克隆形成數(shù)減少，且呈劑量依賴性遞減(P<0.05；圖1)。

圖1 土貝母苷甲對T24細胞增殖及克隆形成的影響

2.2 土貝母苷甲對T24細胞遷移、侵襲的影響

低、中、高劑量組遷移及侵襲細胞數(shù)均低于對照組(P<0.05；圖2)。

圖2 土貝母苷甲對T24細胞遷移及侵襲的影響

2.3 土貝母苷甲對T24細胞miR-215-5p表達、MMP-2和MMP-9蛋白水平的影響

與對照組比較，低、中、高劑量組miR-215-5p表達升高，MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，且均呈劑量依賴性(P<0.05；圖3)。

圖3 土貝母苷甲對T24細胞miR-215-5p表達、MMP-2和MMP-9蛋白水平的影響

2.4 miR-215-5p過表達對T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響

miR-215-5p組細胞存活率以及MMP-2、MMP-9蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05)，細胞克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)也均低于miR-NC組(P<0.05；圖4)。

圖4 miR-215-5p過表達對T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響

2.5 抑制miR-215-5p表達可逆轉(zhuǎn)土貝母苷甲對T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的作用

土貝母苷甲30 mg/L+anti-miR-215-5p組細胞存活率、克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細胞數(shù)以及MMP-2、MMP-9蛋白水平均高于土貝母苷甲30 mg/L+anti-miR-NC組(P<0.05；圖5)。

圖5 抑制miR-215-5p表達可逆轉(zhuǎn)土貝母苷甲對T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響

3 討 論

膀胱癌細胞轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)率高及預(yù)后不良的重要原因，手術(shù)結(jié)合放化療是膀胱癌的主要治療手段，但具有較大的不良反應(yīng)，目前中藥提取物成為治療膀胱癌的研究重點[7]。miRNA可結(jié)合3′UTR的目標(biāo)信使RNA(mRNA)并影響其轉(zhuǎn)錄過程，還可能作為膀胱癌治療的潛在靶點[8-9]。但中藥提取物是否以miRNA為靶點而發(fā)揮抗膀胱癌作用尚需進一步探究。

土貝母苷可抑制非小細胞肺癌[10]、膠質(zhì)母細胞瘤[11]、前列腺癌[12]細胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，土貝母苷甲具有降低T24細胞存活率以及減少其克隆形成功效，且呈質(zhì)量濃度依賴性，證實土貝母苷甲能夠?qū)Π螂装┘毎鲋尺^程與克隆形成產(chǎn)生抑制作用。MMP-2、MMP-9可通過降解細胞外基質(zhì)而增強細胞轉(zhuǎn)移[13]。本研究結(jié)果顯示，對于癌細胞遷移與侵襲、MMP-2及MMP-9能夠產(chǎn)生明顯抑制作用，呈現(xiàn)藥物劑量依耐性降低趨勢，證實土貝母苷甲能夠?qū)24細胞的侵襲與遷移行為具有抑制作用。

miR-215-5p可通過靶向Sox9而抑制乳腺癌細胞侵襲[14]。miR-215-5p低表達量與結(jié)直腸癌患者臨床分期、不良預(yù)后有關(guān)[15]。miR-215-5p可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[16]。miR-215-5p可抑制間皮瘤進展[17]。本研究結(jié)果顯示，隨著土貝母苷甲質(zhì)量濃度的不斷升高，膀胱癌細胞中miR-215-5p的表達量逐漸升高，抑制miR-215-5p表達可降低土貝母苷甲對膀胱癌細胞惡性行為的抑制作用；提示土貝母苷甲通過調(diào)控miR-215-5p表達而調(diào)節(jié)膀胱癌細胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，土貝母苷甲可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲行為，其作用機制與促進miR-215-5p的表達有關(guān)。但關(guān)于其具體作用機制仍需進一步探究。