陳海燕， 朱鴻秋， 朱 影， 胡小丹， 吳沛娟， 吳晗雪

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院，四川 成都 610072)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種以雄激素過(guò)高、排卵障礙和卵巢多囊樣改變?yōu)榕R床特征的內(nèi)分泌紊亂綜合征，也是導(dǎo)致育齡期女性月經(jīng)失調(diào)和不孕的重要原因[1]，絕經(jīng)期患者發(fā)生高血壓、糖尿病、心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)較健康女性明顯增高[2]，是危害女性健康的難治病。目前，治療PCOS大多采用生活方式干預(yù)、激素或手術(shù)的綜合方案，但存在治療周期長(zhǎng)、并發(fā)癥多、療效欠佳等問(wèn)題。

桂枝茯苓丸作為婦科經(jīng)典名方，既往研究發(fā)現(xiàn)其輔助治療PCOS，在調(diào)整內(nèi)分泌、改善代謝水平、促排卵等方面效果甚佳[3-4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸可調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞過(guò)度自噬，從而緩解PCOS大鼠的排卵障礙[5]，但其對(duì)自噬更深層次的調(diào)控機(jī)制尚不明確。研究表明，lncRNAH19和miR-29b-3p不僅參與卵巢功能的調(diào)控及有關(guān)疾病的發(fā)生[6-7]，而且與全身多處細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，本研究通過(guò)探討桂枝茯苓丸含藥血清是否可以調(diào)節(jié)H19/miR-29b-3p表達(dá)，參與卵巢顆粒細(xì)胞自噬的調(diào)控，以期為桂枝茯苓丸治療PCOS提供一定的依據(jù)，并為后續(xù)的治療提供基因靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 40只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～20 g，未孕，6周齡，購(gòu)于南京大學(xué)動(dòng)物模式中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2015-0001，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，設(shè)定室內(nèi)溫度為(22±2)℃，自由飲水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(川)2019-049。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 細(xì)胞株 正常小鼠卵巢顆粒細(xì)胞；PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，為實(shí)驗(yàn)室自行提取。

1.3 試劑與藥物 桂枝茯苓丸(成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，批號(hào)Z2002370)，取140.4 mg，研缽研磨后加入20 mL無(wú)菌生理鹽水制成混懸液。胎牛血清(FBS)(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SH30071.03HI)；DMEM F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)31330095)；青霉素、鏈霉素、巴佛洛霉素A1、嘌呤霉素(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)I9532、85886、196000、540222)；睪酮(T)ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司，批號(hào)KGE010)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)KGA224)；十二烷基硫酸鈉[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號(hào)A100227]；蛋白裂解液(RIPA)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0013B)；q-PCR試劑盒、Trizol試劑、質(zhì)粒抽提試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)RR014A、9108Q、6023D)；SYBR Green miRNA熒光定量PCR試劑盒、組織/細(xì)胞miRNA提取試劑盒(哈爾濱新海基因檢測(cè)有限公司)；iScript cDNA合成試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司，批號(hào)1708890)；pLVX-EGFP-C1載體(美國(guó)Creative Biogene公司，批號(hào)OVT2755)；Lipofectamine? RNAiMAX、Lipofectamine 3000(美國(guó)Thermo Fisher公司，批號(hào)13778030、L3000001)；螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、QuickMutationTMPlus基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)RG052S、D0208S)；pMIR-REPORT 質(zhì)粒(美國(guó)Ambion公司，批號(hào)AM5795)；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)B抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)2775)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)山羊抗兔、兔抗小鼠免疫球蛋白 G(IgG)(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab8245、ab6721、ab6728)。miR-29b-3pinhibitor(序列UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU)、inhibitor-NC(序列 CAGUACUUUUGUGUAGUACAA)(南京達(dá)恩醫(yī)藥科技有限公司)。

1.4 儀器 Criterion型電泳槽、Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；Tanon 6600型發(fā)光成像工作站(上海天能科技有限公司)；3K15型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；EG1150H型石蠟包埋機(jī)、RM2245型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；CKX31型倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；LB941型微孔板式多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)Berthold公司)；ZS-MV-IV型小動(dòng)物麻醉機(jī)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；DxFlex型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI公司)；Nanodrop 2000型超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 模型建立 將20只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和模型組，每組10只，使用來(lái)曲唑CMC溶液+高脂乳劑進(jìn)行造模[8]，連續(xù)灌胃21 d，禁食12 h后處死，采用HE染色鏡檢+血清睪酮檢測(cè)+體質(zhì)量監(jiān)測(cè)來(lái)確認(rèn)造模成功與否[9]；對(duì)照組僅使用CMC溶液灌胃21 d。所有小鼠造模期間均正常飲水，喂養(yǎng)顆粒飼料。

2.2 含藥血清制備 將20只小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，分別灌胃給予70.2 mg/kg桂枝茯苓丸混懸液和等體積生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d，最后1次灌胃后1 h麻醉小鼠，腹主動(dòng)脈采血，常溫靜置4 h，3 000 r/min離心15 min，取血清，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，56 ℃水浴滅活30 min，將滅活后的小鼠空白血清和桂枝茯苓丸含藥血清置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 卵巢顆粒細(xì)胞分離及培養(yǎng) 將“2.1”項(xiàng)下正常小鼠和PCOS小鼠處死后，于無(wú)菌條件下摘除卵巢，PBS沖洗3次，去除周圍脂肪和被膜，用1 mL注射器針頭刺破卵巢卵泡，收集顆粒細(xì)胞，0.075 mm篩網(wǎng)過(guò)濾，離心后棄上清，加入完全培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10% FBS 的 DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸，觀察細(xì)胞貼壁情況，待長(zhǎng)至90%融合度時(shí)消化、收集，用完全培養(yǎng)基重懸，正常小鼠卵巢顆粒細(xì)胞和PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞分瓶培養(yǎng)，隔天換液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 卵巢顆粒細(xì)胞分組及給藥 ①為驗(yàn)證PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的自噬水平，明確H19和miR-29b-3p在PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及桂枝茯苓丸含藥血清干預(yù)后兩者的變化，將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、桂枝茯苓丸含藥血清組，對(duì)照組和模型組使用10%空白血清培養(yǎng)72 h；桂枝茯苓丸組使用10%含藥血清培養(yǎng)72 h。②為明確桂枝茯苓丸含藥血清對(duì)PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬的影響，以及調(diào)控H19/miR-29b-3p表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞自噬的影響，將細(xì)胞分為模型組、桂枝茯苓丸含藥血清組、桂枝茯苓丸含藥血清+oe-Vector組、桂枝茯苓丸含藥血清+oe-H19組、桂枝茯苓丸含藥血清+inhibitor-NC組、桂枝茯苓丸含藥血清+miR-29b-3p-inhibitor組，模型組使用10%空白血清培養(yǎng)72 h；桂枝茯苓丸含藥血清組使用10%含藥血清培養(yǎng)72 h；桂枝茯苓丸含藥血清+oe-Vector組卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒后使用10%含藥血清培養(yǎng)72 h；桂枝茯苓丸+oe-H19組卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染H19高表達(dá)質(zhì)粒后使用10%含藥血清的培養(yǎng)72 h；桂枝茯苓丸含藥血清+inhibitor-NC組卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor-NC后使用10%含藥血清培養(yǎng)72 h；桂枝茯苓丸含藥血清+miR-29b-3p-inhibitor組卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b-3p-inhibitor后使用10%含藥血清培養(yǎng)72 h。

2.5H19基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建 針對(duì)H19的基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，PCR擴(kuò)增H19的基因片段，將其插入到慢病毒載體pLVX-EGFP-C1之中，構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒，鑒定測(cè)序后將重組慢病毒質(zhì)粒、pHelper1.0載體質(zhì)粒和 pHelper 2.0載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞中，包裝產(chǎn)生慢病毒，并測(cè)定滴度。轉(zhuǎn)染前24 h，將PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，以每孔0.5×105個(gè)的密度接種至24孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，將孔內(nèi)培養(yǎng)基換成0.5 mL Polybrene-培養(yǎng)基混合物，根據(jù)感染復(fù)數(shù)(MOI)值，向每孔內(nèi)加入20 μL慢病毒，孵育過(guò)夜，棄去液體，每孔加入1 mL完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按照1∶3比例進(jìn)行傳代，培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)基換成含200 μg/mL嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株。

2.6 miRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，接種適量細(xì)胞至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60%～80%后，開(kāi)始轉(zhuǎn)染。使用滅菌ddH2O配制濃度為20 μmol/L的母液；取10 μL miRNA inhibitor加入250 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，記為A液；取15 μL RNAiMAX Reagent加入250 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，記為B液；將A液與B液輕輕混勻后，超凈臺(tái)上靜置20 min?；旌衔镬o置期間，吸棄6孔板中培養(yǎng)基，每孔加入2 mL OPTI-MEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20 min，吸棄培養(yǎng)基，分別將miR-29b-3pinhibitor(100 nmol/L)、miR-29b-3pinhibitor NC(100 nmol/L)與轉(zhuǎn)染試劑混合物加入6孔板中，再加入1.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，混合均勻，在37 ℃下培養(yǎng)48 h。

2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-REPORT-LncRNAH19，利用QuickChange Mutagenesis Kits試劑盒將pMIR-REPORT-LncRNAH19中LncRNAH19與miR-29b-3p的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變。將293 T細(xì)胞按50%的密度接種到96孔板內(nèi)，按照實(shí)驗(yàn)需要分為L(zhǎng)ncRNAH19-WT+mimics-NC、LncRNAH19-MT+mimics-NC、LncRNAH19-WT+miR-29b-3pmimics、LncRNAH19-MT+miR-29b-3pmimics。配置含有質(zhì)粒、mimics-NC/miR-29b-3pmimics、Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑的混合溶液，室溫靜置20 min，將其加入96孔板中，轉(zhuǎn)染48 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

2.8 檢測(cè)指標(biāo)

2.8.1 小鼠體質(zhì)量、睪酮水平及卵巢病理形態(tài)學(xué)檢測(cè) 自造模起，每3 d于灌胃前固定時(shí)間稱量小鼠體質(zhì)量，記錄體質(zhì)量變化。小鼠造模結(jié)束后禁食12 h，麻醉后腹腔主動(dòng)脈采血，室溫靜置2 h，4 ℃、1 500×g離心10 min，取血清，ELISA法檢測(cè)睪酮水平。取小鼠卵巢組織，將其制作成石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，蘇木素核染，鹽酸乙醇分化，伊紅染液染色，脫水、透明后中性樹(shù)膠封片，于相差顯微鏡400倍視野下觀察并拍照。

2.8.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞自噬率 細(xì)胞按“2.4”項(xiàng)下方法處理，胰酶消化后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，取適量細(xì)胞懸液至EP管中，MDC染色，濃度為0.05 mmol/L，37 ℃孵育60 min，PBS清洗后，采用流式細(xì)胞儀定量分析其著色熒光強(qiáng)度(488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)30 000個(gè)細(xì)胞)。

2.8.3 RT-qPCR法檢測(cè)LncRNAH19、miR-29b-3pmRNA表達(dá) 細(xì)胞按“2.4”項(xiàng)下方法處理，收集細(xì)胞，LncRNAH19的檢測(cè)采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000檢測(cè)mRNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，利用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。miR-29b-3p的檢測(cè)使用miRNA提取試劑盒抽提miRNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配置體系為microRNA 4 μL、4×One step miRNA RT Solution 5 μL、10×miRNA RT Primer 2 μL、RNase Free H2O補(bǔ)至20 μL，利用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.8.4 Western blot法檢測(cè)LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá) 細(xì)胞按“2.4”項(xiàng)下方法處理后收集，加入RIPA細(xì)胞裂解液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×loading buffer沸水浴10 min，即得蛋白樣品，在-20 ℃下保存?zhèn)溆?，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入LC3 Ⅱ/Ⅰ一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，采用Tanon 6600發(fā)光成像工作站曝光，Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)條帶光密度值進(jìn)行分析，將目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 PCOS模型建立 與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、血清睪酮水平均升高(P<0.01)，見(jiàn)圖1A～1B。如圖1C所示，對(duì)照組小鼠顆粒細(xì)胞排列整齊致密，層次較多，卵泡膜細(xì)胞層無(wú)明顯增厚；模型組小鼠顆粒細(xì)胞排列疏松，部分有脫落，層次減少，卵泡膜細(xì)胞層增厚，卵巢閉鎖卵泡增加，卵泡的直徑增大，提示造模成功。

3.2 PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬水平 如圖2A所示，與對(duì)照組比較，模型組卵巢顆粒細(xì)胞自噬率增加(P<0.01)。如圖2B所示，與對(duì)照組比較，模型組卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。與瞬時(shí)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達(dá)比較，一段時(shí)間內(nèi)兩者積聚程度更能體現(xiàn)自噬的改變，因此，2組同時(shí)添加10 nmol/L巴佛洛霉素A1對(duì)自噬溶酶體降解途徑進(jìn)行阻斷，結(jié)果同樣顯示LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。

3.3 桂枝茯苓丸含藥血清對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞H19、miR-29b-3pmRNA表達(dá)的影響 如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組卵巢顆粒細(xì)胞中H19 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，miR-29b-3pmRNA表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，桂枝茯苓丸含藥血清組卵巢顆粒細(xì)胞中H19、miR-29b-3pmRNA表達(dá)發(fā)生逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。

3.4H19與miR-29b-3p的靶向關(guān)系 如圖4所示，與mimics-NC+LncRNAH19-WT比較，miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-WT熒光素酶活性降低(P<0.01)；與miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-WT比較，miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-MT熒光素酶活性升高(P<0.01)，說(shuō)明H19和miR-29b-3p有結(jié)合位點(diǎn)。

3.5 桂枝茯苓丸含藥血清及調(diào)控H19/miR-29b-3p表達(dá)對(duì)PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬率的影響 如圖5所示，與模型組比較，桂枝茯苓丸含藥血清組卵巢顆粒細(xì)胞自噬率降低(P<0.01)，提示桂枝茯苓丸含藥血清可降低PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬水平；過(guò)表達(dá)H19或抑制miR-29b-3p表達(dá)后，卵巢顆粒細(xì)胞自噬率仍升高(P<0.01)，提示過(guò)表達(dá)H19或抑制miR-29b-3p的表達(dá)均可減弱桂枝茯苓丸對(duì)PCOS小鼠顆粒細(xì)胞過(guò)度自噬的抑制作用。

3.6 桂枝茯苓丸含藥血清及調(diào)控H19/miR-29b-3p表達(dá)對(duì)PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與模型組比較，桂枝茯苓丸含藥血清組卵巢顆粒細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，提示桂枝茯苓丸含藥血清可降低PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬水平；過(guò)表達(dá)H19或抑制miR-29b-3p表達(dá)后，卵巢顆粒細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)仍升高(P<0.01)，提示過(guò)表達(dá)H19或抑制miR-29b-3p的表達(dá)可減弱桂枝茯苓丸對(duì)PCOS小鼠顆粒細(xì)胞過(guò)度自噬的抑制作用。本組實(shí)驗(yàn)同樣添加了10 nmol/L巴佛洛霉素A1對(duì)自噬溶酶體降解途徑進(jìn)行阻斷，以消除其影響，各組結(jié)果趨勢(shì)與未添加巴佛洛霉素A1一致。

4 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來(lái)PCOS發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，我國(guó)育齡期女性患病率為5.6%[10]，PCOS患者約占不孕人群的1/3[11]。盡管對(duì)PCOS的研究開(kāi)展多年，其病因和發(fā)病機(jī)制仍然不明確，也缺乏針對(duì)性的治療藥物和手段。越來(lái)越多證據(jù)表明，非編碼RNA和自噬與PCOS發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)[12-13]，非編碼RNA可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，影響多種疾病發(fā)生發(fā)展[14]，但目前在關(guān)于PCOS的研究中，并未見(jiàn)報(bào)道。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PCOS屬于“不孕”“癥瘕”“閉經(jīng)”范疇，“痰濕瘀血”是其主要病機(jī)[15]。桂枝茯苓丸的君藥桂枝溫通行瘀滯；臣藥桃仁助君祛瘀；佐藥丹皮、芍藥活血散瘀，茯苓滲濕利濁，全方共奏化痰利水、活血化瘀之功，契合PCOS痰濕瘀血之病機(jī)。

非編碼RNA是指不翻譯蛋白的RNA，其中包括LncRNA和miRNA，可在多個(gè)水平調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在PCOS中應(yīng)用潛力巨大，多種非編碼RNA在PCOS患者或動(dòng)物模型的血清、卵泡液、顆粒細(xì)胞中均有不同程度的差異表達(dá)，可作為特異性的診斷和治療靶點(diǎn)[12]。H19是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的LncRNA，研究人員發(fā)現(xiàn)在PCOS患者的血液、卵巢顆粒細(xì)胞中，H19表達(dá)升高，認(rèn)為其可作為生物學(xué)標(biāo)志物為PCOS的診斷提供參考[16-17]。LncRNA最常見(jiàn)的調(diào)節(jié)機(jī)制是作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA與miRNA 相結(jié)合調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[18]。王滟等[19]在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，H19表達(dá)上調(diào)，miR-29b-3p表達(dá)下調(diào)，H19可靶向下調(diào)miR-29b-3p促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究證實(shí)，在PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中H19表達(dá)升高，miR-29b-3p表達(dá)降低，使用桂枝茯苓丸含藥血清干預(yù)后，顆粒細(xì)胞中H19、miR-29b-3p表達(dá)發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示H19與miR-29b-3p有結(jié)合位點(diǎn)，故推測(cè)桂枝茯苓丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)H19/miR-29b-3p表達(dá)起到治療PCOS的作用。

多項(xiàng)研究表明，PCOS卵巢顆粒細(xì)胞自噬異常激活，過(guò)度自噬會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破環(huán)，影響卵細(xì)胞正常發(fā)育，導(dǎo)致排卵障礙和性激素合成失調(diào)[20-21]，通過(guò)改變顆粒細(xì)胞自噬水平有望成為治療PCOS的新方法。自噬受多種信號(hào)分子調(diào)節(jié)，研究表明非編碼RNA可通過(guò)參與自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[22]。H19和miR-29b-3p曾被證實(shí)在多種腫瘤疾病中參與對(duì)自噬的調(diào)控，H19在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲除H19后，可下調(diào)自噬小泡及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，增加細(xì)胞活性[23]；在胃癌細(xì)胞中miR-29b-3p表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-29b-3p可下調(diào)其靶基因，從而調(diào)節(jié)自噬[24]，因此，H19/miR-29b-3p很可能是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬水平升高，與既往研究相一致，桂枝茯苓丸含藥血清可降低其自噬水平，而過(guò)表達(dá)H19或抑制miR-29b-3p表達(dá)，則減弱了桂枝茯苓丸對(duì)PCOS小鼠顆粒細(xì)胞過(guò)度自噬的抑制作用，說(shuō)明H19/miR-29b-3p參與調(diào)控PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬。

綜上所述，桂枝茯苓丸含藥血清可通過(guò)調(diào)控H19/miR-29b-3p途徑，抑制PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬水平，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞起保護(hù)作用，為桂枝茯苓丸防治PCOS提供了新的思路和方法。